連接酶-輔助的核酸環(huán)化和擴(kuò)增的制作方法
【專利說明】連接酶-輔助的核酸環(huán)化和擴(kuò)増 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明主要涉及包括經(jīng)由模板-非依賴性單鏈DNA連接，從單鏈或雙鏈線性DNA 生成單鏈DNA環(huán)的核酸測定法。本發(fā)明還涉及單鏈DNA環(huán)經(jīng)由滾環(huán)擴(kuò)增的擴(kuò)增和/或檢 測。單鏈DNA環(huán)的生成和后續(xù)的DNA擴(kuò)增在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行，而無需任何插入的分離 和/或純化步驟。還提供用于進(jìn)行該方法的試劑盒。
[0002] 背景 DNA擴(kuò)增是一個復(fù)制目標(biāo)雙鏈DNA (dsDNA)以生成其多個拷貝的過程。因?yàn)閐sDNA的 各條鏈?zhǔn)欠雌叫械暮突パa(bǔ)的，每條鏈可用作其互補(bǔ)鏈產(chǎn)生的模板鏈。模板鏈作為整體或作 為截短的部分保留，而互補(bǔ)鏈通過DNA聚合酶從脫氧核苷三磷酸（dNTP)裝配?；パa(bǔ)鏈合成 從雜交至模板鏈的引物序列的3 '末端開始，以5 ' - 3 '方向進(jìn)行。
[0003] 全基因組擴(kuò)增（WGA)包括目標(biāo)DNA的非-特異性擴(kuò)增。WGA往往通過多重置換擴(kuò) 增（MDA)技術(shù)，采用在目標(biāo)DNA的多個位置引發(fā)DNA合成的隨機(jī)寡核苷酸引物連同具有鏈 置換活性的高保真性DNA聚合酶（如，Phi29聚合酶）一起實(shí)現(xiàn)。盡管目前可市售獲得的 WGA系統(tǒng)例如GenomiPhi (GE Healthcare, USA)和RepliG (Qiagen)試劑盒提供具有高分 子量目標(biāo)DNA的最佳結(jié)果，但當(dāng)目標(biāo)DNA短和/或高度片段化時，這些系統(tǒng)的性能是差的。 當(dāng)目標(biāo)DNA被片段化和序列長度少于約1000個核苷酸時，使用常規(guī)方法擴(kuò)增目標(biāo)DNA導(dǎo)致 擴(kuò)增速度降低，顯著的序列丟失（特別是在接近目標(biāo)DNA的末端），和高度的序列-偏倚擴(kuò) 增。隨著模板DNA的長度減少，在MDA反應(yīng)中引導(dǎo)該鏈的可能性成倍地減少。這降低了這 些較短片段的擴(kuò)增潛力。因此，用于非-特異性地?cái)U(kuò)增短的、片段化DNA的有效方法是高度 合乎需要的。
[0004] 連接-介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)已被用來擴(kuò)增片段化dsDNA。然而，在這些反應(yīng) 中，只有小部分的片段化DNA得到擴(kuò)增，導(dǎo)致基因組覆蓋不足。為有效地?cái)U(kuò)增片段化的目標(biāo) dsDNA，可首先修復(fù)它們，然后通過鈍端連接被串聯(lián)化，以生成長于1000個堿基對（bp)的序 列。然而，往往需要相對較高濃度的目標(biāo)DNA以促進(jìn)串聯(lián)化（concatamerization)和后續(xù) 的擴(kuò)增。雙鏈目標(biāo)DNA的環(huán)化也被用于各種基于核酸的測定法，包括MDA、WGA、超支化滾環(huán) 擴(kuò)增（RCA)和大規(guī)模平行DNA測序。為了有效地環(huán)化和擴(kuò)增片段化dsDNA，片段化DNA的雙 鏈末端被首先修復(fù)，接著經(jīng)鈍端連接，以形成雙鏈DNA環(huán)。然而，環(huán)化長度少于500 bp的雙 鏈DNA片段是困難的。
[0005] 雙鏈DNA可被變性以產(chǎn)生單鏈DNA (ssDNA)，其可在模板-依賴性分子內(nèi)連接反應(yīng) 中使用連接酶而被進(jìn)一步環(huán)化。然而，需要目標(biāo)DNA的現(xiàn)有序列信息，以進(jìn)行模板-依賴性 環(huán)化。ssDNA的模板-非依賴性分子內(nèi)連接也已有文獻(xiàn)記載。例如，TS2126 RNA連接酶（可 以商標(biāo)名 ThermoPhage? RNA連接酶 II 或 ThermoPhage? ssDNA連接酶（Prokaria, Matis, Iceland)或CircLigase? ssDNA連接酉每（Epicenter Biotechnologies, Wisconsin, USA) 經(jīng)市售獲得）已被用于制備數(shù)字（digital) DNA球，和/或DNA，例如基因組DNA的位點(diǎn)-特 異性裂解和擴(kuò)增。從mRNA的5'-端片段制備的線性單鏈互補(bǔ)DNA (cDNA)分子在使用 TS2126 RNA連接酶環(huán)化后，也已通過滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增。通過適當(dāng)?shù)貙⒂辛xRNA聚合酶啟動子 序列摻入cDNA中，已顯示環(huán)化的cDNA模板作為轉(zhuǎn)錄底物起作用，并因而進(jìn)行在生物學(xué)樣 本中的mRNA分子的擴(kuò)增。此外，TS2126 RNA連接酶已被用來擴(kuò)增用于隨機(jī)擴(kuò)增cDNA末端 (RACE)的cDNA末端。通過采用TS2126 RNA連接酶，還從有限量的片段化DNA，生成用于 滾環(huán)擴(kuò)增的DNA模板。該方法包括使線性的片段化dsDNA變性以獲得線性ssDNA片段，用 CircLigase? ssDNA連接酶連接線性ssDNA以獲得單鏈DNA環(huán)，然后使用隨機(jī)引物和Phi29 DNA聚合酶經(jīng)由RCA擴(kuò)增單鏈DNA環(huán)。然而，即使在優(yōu)化反應(yīng)條件后，生成的單鏈環(huán)狀DNA 的量是高度可變和序列依賴性的。例如，在相同的連接條件下，包含5 ' G和3 ' T核苷酸 的寡核苷酸比其包含5 ' A和3 ' C的互補(bǔ)寡核苷酸顯著更好地連接。此外，分子內(nèi)連接 效率在具有相同的或極其類似大小的線性ssDNA序列中變化，但在核苷酸序列中有小的差 異。效率在不同大小的線性ssDNA序列（如，序列長度范圍從100個堿基至數(shù)千堿基大?。?中也有變化。而且，連接-擴(kuò)增反應(yīng)的所有嘗試涉及中間分離、純化和/或清潔步驟，因而 使得連接-擴(kuò)增工作流程繁瑣。例如，通過環(huán)化，接著滾環(huán)擴(kuò)增的片段化DNA的法醫(yī)樣本的 分析以多步驟進(jìn)行，包括5' DNA磷酸化、接頭連接、DNA環(huán)化和全基因組擴(kuò)增。每個步驟 反應(yīng)在進(jìn)行下一步驟之前要經(jīng)受反應(yīng)清理。當(dāng)連接和擴(kuò)增在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行時，未觀 察到擴(kuò)增優(yōu)點(diǎn)。然而，多步驟過程往往造成模板DNA的丟失并導(dǎo)致分析失敗。用于在單一 反應(yīng)容器中非-特異性地?cái)U(kuò)增短的DNA序列，而無任何序列偏倚和任何插入的清潔步驟的 有效方法因而是尚度需要的。
[0006] 簡述 在一些實(shí)施方案中，提供一種從線性DNA生成單鏈DNA環(huán)的方法。該方法包括提供線性 DNA，通過在磷酸供體的存在下使其與多核苷酸激酶一起孵育將線性DNA末端修復(fù)以生成 具有在5'末端的磷酸基團(tuán)和在3'末端的羥基的可連接的DNA序列，和用連接酶對經(jīng)修復(fù) 的可連接的DNA序列進(jìn)行分子內(nèi)連接以生成單鏈DNA環(huán)的步驟。該方法的所有步驟在單一 反應(yīng)容器中進(jìn)行，而無需任何插入的分離或純化步驟。磷酸供體可以是鳥苷三磷酸（GTP)、 胞苷三磷酸（CTP)、尿苷三磷酸（UTP)、脫氧胸苷三磷酸（dTTP)或其組合。線性DNA可以是 雙鏈或者單鏈DNA。DNA可以是片段化DNA例如循環(huán)DNA。可連接的DNA，如果呈現(xiàn)為雙鏈 形式，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)之前需要被變性。能夠模板-非依賴性的、分子內(nèi)連接單鏈DNA 序列的預(yù)腺苷酸化連接酶可被用于連接反應(yīng)。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，提供一種從線性DNA生成單鏈DNA環(huán)的方法，其中該方法在分 子內(nèi)連接步驟之前采用DNA預(yù)腺苷酸化步驟。線性DNA可在腺苷三磷酸（ATP)的存在下， 任選地用多核苷酸激酶孵育，以生成包含在5'末端的磷酸基團(tuán)和在3'末端的羥基的可連 接的DNA序列。如果線性DNA呈現(xiàn)為高度片段化形式，可優(yōu)先從線性DNA生成可連接的DNA 序列。線性DNA或可連接的DNA序列然后在ATP的存在下用腺苷酸化酶孵育，以生成5 ' 腺苷酸化DNA序列。5 '腺苷酸化DNA序列然后用非-腺苷酸化連接酶孵育，該酶能夠進(jìn)行 模板-非依賴性分子內(nèi)連接5 '腺苷酸化DNA序列，以生成單鏈DNA環(huán)。該方法的所有步 驟在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行，而無需任何插入的分離或純化步驟。如果非-腺苷酸化連接酶 是ATP-依賴性連接酶，在分子內(nèi)連接反應(yīng)前，ATP可必須從反應(yīng)混合物中除去（如，通過用 磷酸酶處理反應(yīng)混合物）。如果5 '腺苷酸化DNA呈現(xiàn)為雙鏈形式，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)前 需要變性。
[0008] 附圖 本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)參照附圖閱讀以下詳細(xì)描述時，將變得更易 理解。
[0009] 圖1說明片段化dsDNA的連接酶-輔助全基因組擴(kuò)增的實(shí)施方案的示意圖。
[0010] 圖2說明從健康個體的血漿分離的循環(huán)DNA的大小分布。
[0011] 圖3說明使用不同的連接酶從血液提取的循環(huán)DNA的連接酶-輔助全基因組擴(kuò) 增。
[0012] 圖4說明用于4種不同的CODIS位點(diǎn)的靈敏的和平衡的DNA擴(kuò)增的連接酶-輔助 全基因組擴(kuò)增的效力。
[0013] 圖5說明用于12種不同的CODIS位點(diǎn)的靈敏的和平衡的DNA擴(kuò)增的連接酶-輔 助全基因組擴(kuò)增的效力。
[0014] 圖6說明在不同的反應(yīng)和緩沖條件下，連接酶-輔助的全基因組擴(kuò)增的效率。
[0015] 圖7說明在連接酶-輔助的全基因組擴(kuò)增中，高分子量基因組DNA擴(kuò)增的抑制作 用。
[0016] 圖8說明連接酶-輔助的全基因組擴(kuò)增的示意圖，其包括使用多核苷酸激酶處理 (如，末端修復(fù)）片段化DNA，接著是經(jīng)處理的片段化DNA的連接酶-輔助的擴(kuò)增。
[0017] 圖9說明在GTP的存在下，采用PNK和CircLigase II?的片段化DNA的連接酶-輔 助擴(kuò)增的單管反應(yīng)的示意圖。
[0018] 圖10說明使用雄性-雌性血漿/血的單管連接酶-輔助的擴(kuò)增反應(yīng)，其中DYS14 雄性-特異性標(biāo)記物使用從輸入DNA創(chuàng)立的庫檢測。
[0019] 圖11說明片段化DNA的磷酸化和預(yù)腺苷酸化，接著使用基本上非-腺苷酸化連接 酶連接的示意圖。
[0020] 圖12說明使用基本上非-腺苷酸化連接酶環(huán)化預(yù)腺苷酸化DNA序列的提高的效 率。
[0021] 圖13說明當(dāng)目標(biāo)DNA序列被預(yù)腺苷酸化和當(dāng)使用非-腺苷酸化連接酶進(jìn)行連接 時，連接酶-輔助全基因組擴(kuò)增的提高的效率。
[0022] 詳細(xì)描述 以下詳細(xì)描述是示例性的并不打算限制本發(fā)明或本發(fā)明的應(yīng)用。貫穿整個說明書，具 體術(shù)語的舉例說明應(yīng)視為非-限制性實(shí)例。單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)指代，除 非文中另外清楚地指明。近似語言，如本文貫穿說明書和權(quán)利要求書中所用的，可用于修飾 任何定量的表示，其可允許變化而不導(dǎo)致其相關(guān)基本功能的改變。因此，由術(shù)語如"約"修飾 的值并不限于所指定的精確值。除非另外指明，否則表示本說明書和權(quán)利要求書中所用的 成分的量、特性如分子量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字將被理解為在所有的情況下由術(shù)語"約" 修飾。因此，除非有相反的指示，否則在以下本說明書和所附權(quán)利要求書中提出的數(shù)值參數(shù) 是近似值，其可根據(jù)本發(fā)明探尋而獲得的所需特性而變化。最低限度上，以及不試圖限制權(quán) 利要求書范圍的等同原則的適用，每個數(shù)值參數(shù)應(yīng)該至少按照報告的有效數(shù)字的位數(shù)和通 過應(yīng)用普通的四舍五入技術(shù)來解釋。必要時，提供范圍，和那些范圍包括之間所有的子范 圍。為了更清楚地和準(zhǔn)確地描述和指出要求保護(hù)的發(fā)明的主題，對在以下描述和所附權(quán)利 要求書中使用的具體術(shù)語提供以下定義。
[0023] 如本文所用的，術(shù)語"核苷"指糖胺化合物，其中核酸堿基（核堿基）連接于糖部 分。"核苷酸"指核苷磷酸。核苷酸可使用對應(yīng)于其核苷的按字母順序排列的字母（字母代 號）表不，如在表1中所述。例如，A表不腺苷（含有核堿基的核苷，腺噪呤），C表不胞苷， G表示鳥苷，U表示尿苷，和T表示胸苷（5-甲基尿苷）。W表示A或者T/U，和S表示G或者 C。N表示隨機(jī)核苷和dNTP指脫氧核糖核苷三磷酸。N可以是A、C、G或T/U的任何一個。
[0024] 表1 :各種核苷酸的字母名稱。
[0025] 如本文所用的，術(shù)語"核苷酸類似物"指在結(jié)構(gòu)上與天然存在的核苷酸類似的化 合物。核苷酸類