煙草光受體基因NtPHYB1、其編碼蛋白及在煙葉多酚調(diào)控中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一個(gè)煙草光受體基因、其編碼蛋白及其在煙葉多酚代謝調(diào)控中的應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
多酚類化合物對(duì)煙草品質(zhì)、色澤和煙氣生理強(qiáng)度等方面有著重要影響，因此是衡量煙草質(zhì)量的一個(gè)重要因素。曾有人提出以酚類化合物含量與蛋白質(zhì)氮含量的比值作為判斷煙草芳香吃味的依據(jù)。
[0003]已知有許多因素可影響多酚類物質(zhì)在煙草中的含量，包括煙草品種和類型、著生部位、成熟度、光照、溫度、營(yíng)養(yǎng)及調(diào)制方法等。遺傳基因、栽培管理以及調(diào)制技術(shù)的綜合作用決定了各種類型煙草中多酚類物質(zhì)的組分和含量。多酚類化合物的數(shù)量和組分的差異都是可以遺傳的。在煙草中發(fā)現(xiàn)的多酚類及其衍生物種類繁多，因煙草類型和品種的不同，多酚類物質(zhì)含量變化范圍在0.4-6.0%。據(jù)報(bào)道，多酚含量高的品種其后代的多酚含量也高，多酚含量低的品種其后代多酚含量也低。這說明煙草中的多酚含量是受基因控制的，品種間多酚水平的差異能夠傳遞給后代。因而可以通過育種方法來選育多酚含量適宜的煙草品種，但是傳統(tǒng)的育種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程手段挖掘、驗(yàn)證和利用調(diào)控多酚代謝的重要功能基因，將為煙葉多酚類物質(zhì)的分子調(diào)控提供重要的理論和技術(shù)支撐，從而提高煙草品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]
本發(fā)明的目的為了克服上述缺點(diǎn)而提供的一種調(diào)節(jié)煙葉多酚類物質(zhì)含量，從而提高煙草品質(zhì)的煙草NtPHYBl蛋白。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供編碼該煙草NtPHYBl蛋白的心基因。
[0006]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該基因及其編碼蛋白NtPHYBl在調(diào)節(jié)煙葉多酚含量中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的煙草NtPHYBl蛋白為:由SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或在SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的蛋白質(zhì)。
[0008]本發(fā)明的煙草NtPHYB 1 蛋白的 NtPHYBli^M% Nico tiana tabacum Phytochrome方)基因，具有SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
上述的煙草基因是從煙草K326 ( Nico tiana tabacum cv.K326)品種中通過RT-PCR克隆到的一個(gè)基因。
[0009]上述的煙草NtmYBl基因，其過表達(dá)和RNA干擾植物表達(dá)載體分別為pEarleyGatelOO 和 pB7GWIWG2(I)。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知:本發(fā)明的基因的蛋白序列與擬南芥AtPHYB蛋白的氨基酸序列之間的相似性為75%，因此推測(cè)與擬南芥因的功能類似。
[0011]將NtPHYBl基因構(gòu)建到過表達(dá)載體pEarleyGatelOO及RNA干擾載體PB7GWIWG2 (I)上，并在大腸桿菌DH5a中擴(kuò)繁。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化方法，分別將pEarleyGatelOO及pB7GWIWG2 (I)攜帶的價(jià)基因轉(zhuǎn)入普通煙草中，獲得煙草轉(zhuǎn)化植株。結(jié)果表明，過表達(dá)具有上調(diào)苯丙氨酸解氨酶(NtPAL)的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高煙葉多酚類物質(zhì)含量的功能；或通過RNA干擾可降低煙葉中多酚類物質(zhì)含量，從而實(shí)現(xiàn)煙葉多酚類物質(zhì)含量的改良。
[0012]因此，基因及其編碼蛋白可以調(diào)節(jié)煙葉多酚含量，快速、高效地實(shí)現(xiàn)煙草品質(zhì)改良。
[0013]本發(fā)明還可提供含有亥苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其特異片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。
[0014]
【附圖說明】
圖1為煙草光受體基因yVi/^/價(jià)編碼蛋白的氨基酸序列與擬南芥因編碼蛋白的氨基酸序列的比較。
[0015]圖2為克隆中間載體pGWCm的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]圖3為植物過表達(dá)載體pEarleyGatelOO的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖4為植物RNA干擾載體pB7GWIWG2⑴的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖5為煙草光受體基因NtHlYBl概基因植物細(xì)胞中的定位。
[0019]圖6為煙草光受體基因?qū)熑~多酚類物質(zhì)含量的影響。
[0020]圖7為轉(zhuǎn)基因煙葉中多酚類代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平分析。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例1
(1)煙草光受體基因的克隆
分別利用SEQ ID N0.3所示的價(jià)克隆正向引物5’ - ATGGCTTCTGGAAGTAGAACAAAG-3’ 和 SEQ ID N0.4 所示的價(jià)克隆反向引物 5’- CTAGCCAAGACTCTTTGAACCTCTG-3’通過RT-PCR的方法從煙草K326 (Nico tiana tabacum cv.K326)中擴(kuò)增基因。
[0022]PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min 預(yù)變性，95°C 30S，50°C 35S，72°C 3min30S，30 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin 延伸。
[0023]克隆載體的獲得:將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物直接按照TA克隆方法克隆到如圖2所示的克隆中間載體pGWCm上。先將pGWCm載體用Ahd I內(nèi)切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物以獲得T載體。然后PCR產(chǎn)物和T載體于16°C進(jìn)行12小時(shí)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，并在其中擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序。
[0024]獲得的NtPHYBl基因，其基因序列如SEQ ID N0.2所示；由其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0025]( 2 )煙草光受體基因的植物表達(dá)載體及遺傳轉(zhuǎn)化
將煙草光受體基因NtPHYBl的克隆載體分別與如圖3所示的植物過表達(dá)載體pEarleyGatelOO (購(gòu)自Invitrogen)及如圖4所示的植物RNA干擾載體pB7GWIWG2 (I)等比例混合后通過LR反應(yīng)(兩種質(zhì)粒各50ng，LR酶1ml，補(bǔ)ddH20至終體積5ml，混勾后25°C反應(yīng)6小時(shí)以上)，將NtPHYBl取H pEarleyGatelOO及pB7GWIWG2 (I)上，分別用于在植物中過表達(dá)和RNA干擾煙草光受體基因人研究其功能。煙草的遺傳轉(zhuǎn)化方法采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行，參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，2005年。植物中的篩選標(biāo)記為Bar，從而獲得煙草光受體基因的轉(zhuǎn)化植株。
[0026]實(shí)施例2
(1)煙草光受體基因編碼蛋白的氨基酸序列分析
煙草光受體基因的蛋白序列與擬南芥PHYB蛋白之間的相似性為75%，且在保守功能域高度相似，如圖1所示。因此推測(cè)煙草基因與擬南芥因的功能類似。
[0027](2)煙草光受體基因碼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的定位
將煙草光受體基因與677?勺融合基因，轉(zhuǎn)化至擬南芥原生質(zhì)體中。具體方法如下:
1)原生質(zhì)體提取:
將生長(zhǎng)四周左右的擬南芥葉片切成細(xì)條，放入甘露醇溶液中；配制酶解液:將上述溶液55°C加熱lOmin，室溫放置后，加入CaCl2 10mM