一株具有抗氧化活性的副干酪乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有抗氧化活性的副干酪乳桿菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 益生菌是指一類對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的活性微生物，通過定植于宿主腸道、生殖 系統(tǒng)內(nèi)，能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生確切的健康功效，從而改善宿主體內(nèi)微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的 活性微生物的總稱。乳酸菌作為益生菌中最具代表性的菌屬，具有幫助消化、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 的吸收、緩解乳糖不耐癥、預(yù)防和治療腹瀉、調(diào)節(jié)腸道菌群和緩解便秘、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、 降低血液總的膽固醇、改善食物引起的過敏性疾病、延緩衰老及抗腫瘤等生理活性。
[0003] 氧化是生命必需的過程，氧化過程中產(chǎn)生的活性氧自由基對(duì)生理平衡是必需的， 但是過量的自由基在體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生危害。人體自身的抗氧化能力隨年齡的增長(zhǎng)而不斷下降， 所以通過輔助手段來清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基是非常必要的。大量試驗(yàn)研究表明，副干酪 乳桿菌具有抗氧化作用。然而，目前中國(guó)市場(chǎng)的乳酸菌產(chǎn)品使用的菌株多為國(guó)外供應(yīng)商提 供的菌株，如丹麥科漢森公司的動(dòng)物雙歧桿菌BB12、芬蘭維利奧公司的鼠李糖乳桿菌LGG 等，國(guó)內(nèi)研發(fā)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗氧化的菌株少之又少，能夠成功上市的菌株更是鳳 毛麟角。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外研究比較多的有雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、 瑞士乳桿菌等菌株。然而，由于乳酸菌的益生活性具有菌株特異性，不同菌株之間的益生活 性差別較大。因此，需要更有針對(duì)性的篩選具有特殊生理活性的菌株，特別是我國(guó)有大量的 傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其中有大量的乳酸菌亟待研究與開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株具有抗氧化活性的副干酪乳桿菌（Lactobaci I Ius paracasei)NCU622,以便解決中國(guó)市場(chǎng)上乳酸菌產(chǎn)品使用的菌株的國(guó)產(chǎn)化問題。
[0006] 本發(fā)明所述的菌株為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei)NCU622,該菌株 具有抗氧化活性，已于2015年12月16日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所），其簡(jiǎn)稱為 CGMCC，保藏編號(hào)為 CGMCC 11886。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供了一種組合物，該組合物包含所述副干酪乳桿菌NCU622。
[0008] 本發(fā)明所述的組合物可以是食品。
[0009] 本發(fā)明所述的副干酪乳桿菌NCU622為活菌或滅活菌或該菌株的衍生物。
[0010] 所述的食品可以是發(fā)酵果蔬、發(fā)酵乳、乳酪、含乳飲料、乳粉或其他含有該菌株或 該菌株衍生物的食品的任何一種。
[0011] 本發(fā)明所提供的菌株及其組合物具有抗氧化活性。具體包括：
[0012] 具有一定的DPPH自由基的清除能力、輕自由基的清除能力、總還原能力及抗脂質(zhì) 過氧化能力。
[0013] 在發(fā)明所提供的體外試驗(yàn)證實(shí)，副干酪乳桿菌NCU622具有較好的胃腸道環(huán)境耐 受性及較強(qiáng)的黏附性能，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性致病菌均具有較好的抑制作用，具有一定的 抗氧化活性。
[0014] 本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述說明即可利用本發(fā)明至最廣的程度。因此，以 下說明僅作為示例說明，并非以任何方式限制其余的揭露內(nèi)容。若本文所述及的明確完整 事物已在與本發(fā)明有關(guān)的相關(guān)技術(shù)中出現(xiàn)已知的同等物時(shí)，這些已知的同等物將視為獨(dú)立 事項(xiàng)并入本文中。
[0015] 本發(fā)明提供了一株具有抗氧化活性的副干酪乳桿菌NCU622,該菌株或其組合物具 有一定的抗氧化活性。此外，副干酪乳桿菌NCU622還具有較好的胃腸道環(huán)境耐受性及較強(qiáng) 的黏附性能，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性致病菌均具有較好的抑制作用。本發(fā)明菌株可以是食品 形式的組合物，并能發(fā)酵大宗果蔬產(chǎn)生酸鮮可口、營(yíng)養(yǎng)豐富、天然果蔬味濃郁并具有良好保 健功能的益生菌高效發(fā)酵果蔬產(chǎn)品（泡菜、飲料、漿料），產(chǎn)品中無需添加任何香精香料、色 素、酸味劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等食品添加劑，所有風(fēng)味由益生菌發(fā)酵果蔬原料產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622在MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵的過程中， 發(fā)酵液的pH值、酸度的變化情況。
[0017] 圖2為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622在MRS液體培養(yǎng)基中發(fā)酵的過程中， 發(fā)酵液中葡萄糖、乳酸及乙酸含量的變化情況。
[0018] 圖3為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附情況，（a)為 空白圖，（b)為黏附圖。
[0019] 圖4為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定情況。
[0020] 圖5為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定情況。
[0021] 圖6為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622總還原力的測(cè)定情況。
[0022] 圖7為本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622抗脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定情況。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0024] 實(shí)施例1 :菌株的篩選和鑒定。
[0025] 本發(fā)明分離菌株副干酪乳桿菌NCU622是自中國(guó)自然發(fā)酵酸牛奶中分離篩選獲 得，具體分離鑒定步驟如下：
[0026] (1)菌株的分離與培養(yǎng)。
[0027] 取來源不同的中國(guó)自然發(fā)酵酸牛奶，采用10倍梯度稀釋法，選擇適宜稀釋度，涂 布在初篩平板培養(yǎng)基（添加有溴甲酚紫的MRS固體培養(yǎng)基）上，37°C靜置培養(yǎng)24~48h，比 較培養(yǎng)皿中菌落形態(tài)，選擇生長(zhǎng)快、菌落大、黃色菌圈大的菌株。將初篩挑選得到的菌株轉(zhuǎn) 接到復(fù)篩平板培養(yǎng)基上，37°C厭氧培養(yǎng)。挑選在平板上鈣圈較大、較明顯和變黃色較快的菌 株，分別轉(zhuǎn)接到牛膽鹽含量為1. 〇%、PH值為2. 0的復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)20h。分 別取上述復(fù)篩液體培養(yǎng)基，采用平板梯度稀釋法，涂布在復(fù)篩平板培養(yǎng)基上重復(fù)篩選，37°C 厭氧培養(yǎng)約48h，選擇培養(yǎng)基上黃色、菌圈較大的單菌落，經(jīng)過劃線、分離后得到純化的乳酸 菌株 NCU622。
[0028] (2)菌株的初步鑒定。
[0029] 形態(tài)學(xué)鑒定：將菌種活化后涂布于MRS固體平板上培養(yǎng)，取單菌落和革蘭氏染色 后的菌落樣品鏡檢。
[0030] 表1平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果
[0032] 生理生化特性鑒定：用乳酸菌微量發(fā)酵管對(duì)菌株進(jìn)行生化鑒定，根據(jù)菌株NCU622 的形態(tài)特征和生理生化特征，并參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)中有關(guān)乳酸菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn) 行分析，這株菌初步鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)。
[0033] 表2菌株NCU622微量發(fā)酵管鑒定結(jié)果
[0035] (3)菌株的分子生物學(xué)鑒定。
[0036] 取NCU622菌株培養(yǎng)物，離心得到菌體用于基因組的提取。利用細(xì)菌16s rDNA通 用引物 27f: 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和 1492r: 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序得到的結(jié)果與Gene Bank中相關(guān)序列比對(duì)，結(jié)果確定 NCU622為副干酪乳桿菌。
[0037] 實(shí)施例2 :副干酪乳桿菌NCU622生長(zhǎng)代謝分析。
[0038] 將副干酪乳桿菌NCU622接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 分別于 0、2、