一種酒精性脂肪肝斑馬魚模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及模式動物疾病模型的構(gòu)建方法技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種酒精性脂肪肝斑 馬魚模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酒精性脂肪肝是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟受損、肝細胞內(nèi)脂質(zhì)過度堆積的病 變過程，是酒精性肝病中的一個分型。酒精性脂肪變性過程中發(fā)生的肝細胞形態(tài)學(xué)變化和 代謝變化都會給肝細胞帶來更多、更嚴重的損傷，影響肝臟的正常功能。同其他類型的脂 肪肝相比較，酒精性脂肪肝更容易誘發(fā)肝纖維化和肝硬化。由乙醇引起的脂肪肝中20%~ 30%有發(fā)展為肝硬化的可能，甚至?xí)?dǎo)致肝癌。盡管酒精性脂肪肝的發(fā)病機制有多種理論 和假說，但均未能涵蓋其發(fā)生發(fā)展的全部過程，也不能圓滿解釋其臨床現(xiàn)象。因此，對于其 病理過程的研究和新型的治療手段的研制工作就顯得尤其重要。
[0003] 無論是病理研究還是藥物的療效評價均需要良好的動物模型來評價。傳統(tǒng)的酒精 性脂肪肝模型常以大鼠作為試驗對象，多采用灌胃或腹腔注射乙醇的方法，試驗周期約為 8-16周，然而，操作復(fù)雜，樣本量局限，試驗耗費高且周期長等諸多缺點限制了其在高通量 藥物篩選方面的應(yīng)用。為深入酒精性脂肪肝發(fā)病機制和防治基礎(chǔ)研究，選擇一種理想的試 驗動物模型十分必要。
[0004] 目前，斑馬魚已經(jīng)成為國際上疾病研究最重要的脊椎模式動物之一，并成功應(yīng)用 于新藥篩選中。一方面，與大鼠、小鼠等哺乳類模式生物相比，斑馬魚繁殖周期快、易于飼 養(yǎng)。另一方面，斑馬魚遺傳背景清晰，其基因與人類的基因保守度達到85%，具有與人類相 似的造血、神經(jīng)等系統(tǒng)，器官的病變過程與人類也極為相似，而且斑馬魚價格低廉，非常適 合大批量試驗。然而目前，雖然有人用斑馬魚胚胎構(gòu)建酒精性脂肪肝模型，但其缺點是顯而 易見的：采用斑馬魚胚胎作為實驗動物，復(fù)制的疾病模型與人類疾病相似性較差，不能準確 地誘發(fā)出具有類似人類疾病特征的發(fā)生機制，從而不能有效地認識酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā) 展規(guī)律，因此胚胎模型仍然不能成為整體動物水平的藥物篩選方案。用成年斑馬魚進行構(gòu) 建酒精性脂肪肝模型的研究工作仍然未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種相似性高、重復(fù)性好、可靠性強、經(jīng)濟易行的酒精性脂肪 肝斑馬魚模型的構(gòu)建方法。
[0006] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種酒精性脂肪肝斑馬魚模型的構(gòu)建方法， 包括以下步驟：
[0007] 步驟1，實驗室馴養(yǎng)AB系野生型斑馬魚，挑選出健康成年斑馬魚用來構(gòu)建模型；
[0008] 步驟2,采用中心組合設(shè)計的方法設(shè)計實驗條件，將挑選出的成年斑馬魚隨機分為 16組，每組數(shù)量相等；所設(shè)計的實驗條件包括5個乙醇濃度Xp5個暴露時間X 2、5個試驗周 期X3，對16組成年斑馬魚分別按照設(shè)計的實驗條件對應(yīng)進行飼養(yǎng)；
[0009] 步驟3,各組成年斑馬魚按照該組對應(yīng)的實驗條件完成飼養(yǎng)后，剔除死亡個體計算 該組成年斑馬魚的存活率，并取出存活的各成年斑馬魚麻醉后取肝組織進行HE染色，做病 理切片確定各條成年斑馬魚的脂滴面積，最終確定該組成年斑馬魚的平均脂滴面積；
[0010] 步驟4,將步驟4得到的16組成年斑馬魚的存活率和平均脂滴面積兩個指標分別 進行標準差標準化得各組的存活率標準化值和平均脂滴面積標準化值，再將各組的存活率 標準化值和平均脂滴面積標準化值相加然后除以2得加權(quán)平均值即該組成年斑馬魚的綜 合評分；
[0011] 步驟5,將各組成年斑馬魚的綜合評分進行多元回歸分析和二項式擬合得到回歸 方程，根據(jù)回歸方程描繪三維曲面圖以確定酒精性脂肪肝斑馬魚模型的最優(yōu)造模條件即乙 醇濃度X 1、暴露時間X2、試驗周期X3的最優(yōu)解。
[0012] 優(yōu)選地，步驟1所述實驗室馴養(yǎng)AB系野生型斑馬魚，挑選出健康成年斑馬魚用 來構(gòu)建模型，其中所述AB系野生型斑馬魚為輻鰭魚綱鯉形目鯉科短擔(dān)尼爾屬野生型斑馬 魚，體長2. 8~3. 2cm，體重0. 20~0. 25g ;所述實驗室馴養(yǎng)的條件為于長X寬X高為 30X25X25cm的聚碳酸脂材質(zhì)缸內(nèi)飼養(yǎng)4周；所述挑選出的健康成年斑馬魚指體質(zhì)健壯、 無病無傷、規(guī)格一致的個體。
[0013] 優(yōu)選地，步驟2所述將挑選出的成年斑馬魚隨機分為16組，每組數(shù)量相等且均為 15~40條。
[0014] 優(yōu)選地，步驟2所述采用中心組合設(shè)計的方法設(shè)計實驗條件，所設(shè)計的實驗條件 包括5個乙醇濃度Xp5個暴露時間X 2、5個試驗周期X3，其中5個乙醇濃度范圍為 0. 67% -1. 73% (v/v)、5個暴露時間乂2的范圍為0. 94-15. 06小時、5個試驗周期X3的范圍 為1-27 ;并且：
[0015] 乙醇濃度X# 0. 67%時，暴露時間X 2為8小時，試驗周期X 3為14天；
[0016] 乙醇濃度X1S 0. 9%時，暴露時間乂2為4-12小時，試驗周期X 3為7-21天；
[0017] 乙醇濃度X1Sl. 2%時，暴露時間乂2為0. 94-15. 06小時，試驗周期乂3為1. 6-26. 35 天；
[0018] 乙醇濃度X1S 1. 5%時，暴露時間乂2為4-12小時，試驗周期X 3為7-21天；
[0019] 乙醇濃度X# 1. 73%時，暴露時間乂2為8小時，試驗周期X 3為14天。
[0020] 優(yōu)選地，步驟3所述取出存活的各成年斑馬魚麻醉后取肝組織進行HE染色，做病 理切片確定各條成年斑馬魚的脂滴面積，具體為：將取出的成年斑馬魚麻醉后取肝組織，用 0. 7%的生理鹽水沖洗干凈，投入到10%中性緩沖甲醛固定液中，固定24小時，石蠟包埋， 切片厚度為5 μ m，用蘇木素-尹紅HE染色，光鏡下進行病理學(xué)拍照，計算脂滴面積。
[0021 ] 進一步地，步驟4所述標準差標準化的公式如下：
[0022] z = (X- μ ) / 〇
[0023] 其中，ζ為標準化值，χ為具體分數(shù)，μ為平均數(shù)，σ為標準差。
[0024] 進一步地，步驟5所述將各組成年斑馬魚的綜合評分進行多元回歸分析和二項式 擬合得到回歸方程，表達式如下：
[0025] Y = β 0+ β !X1+ β 2Χ2+ β 3Χ3_ β ^X1X2- β J1X3- β 23Χ2Χ3- β ηΧ!2- β 22Χ22- β 33Χ32;
[0026] 其中，Y 表示綜合評分，β 0、β !、β 2、β 3、β 12、β 13、β 23、β η、β 22、β 33均為回歸 方程的系數(shù)。
[0027] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點為：⑴采用成年斑馬魚作為實驗動物，復(fù)制 的疾病模型與人類疾病相似性好，能夠更準確地誘發(fā)出具有類似人類疾病特征的發(fā)生機 制；（2)成本低、周期短、重復(fù)性好、可靠性強，可以有效降低藥理學(xué)實驗和藥物篩選成本， 深入研究酒精性脂肪肝病理機制，為酒精性脂肪肝尋找新的治療手段；（3)有助于認識酒 精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為推動酒精性脂肪肝醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展提供有力基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明酒精性脂肪肝斑馬魚模型的構(gòu)建方法的流程圖。
[0029] 圖2是16組成年斑馬魚的肝組織病理學(xué)染色結(jié)果圖，其中（1)~（16)依次為編 號為1~16的各組成年斑馬魚肝組織病理學(xué)染色結(jié)果圖。
[0030] 圖3是根據(jù)回歸方程描繪的三維曲面圖，其中（a)為乙醇濃度和試驗周期交互作 用的三維曲面圖，（b)為乙醇濃度和暴露時間交互作用的三維曲面圖，（c)為暴露時間和試 驗周期交互作用的三維曲面圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做出進一步詳細說明。
[0032] 結(jié)合圖1，本發(fā)明酒精性脂肪肝斑馬魚模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0033] 步驟1，實驗室馴養(yǎng)AB系野生型斑馬魚，挑選出健康成年斑馬魚用來構(gòu)建模型；
[0034] 步驟2,采用中心組合設(shè)計的方法設(shè)計實驗條件，將挑選出的成年斑馬魚隨機分為 16組，每組數(shù)量相等；所設(shè)計的實驗條件包括5個乙醇濃度Xp5個暴露時間X 2、5個試驗周 期X3，對16組成年斑馬魚分別按照設(shè)計的實驗條件對應(yīng)進行飼養(yǎng)；