一種定點突變改造的大鼠二肽基肽酶iii的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種二肽基肽酶III，特別涉及一種定點突變改造的大鼠來源的二肽 基肽酶III。
【背景技術(shù)】
[0002] 二肽酶III (DPPs III，EC 3.4. 14. 4)，如來自酵母的二肽酶III、來自人類的二肽 酶ΙΠ 、來自大鼠的二肽酶III、來自兔的二肽酶III等，是一組分子內(nèi)含有特殊的HEXXGH 鋅指結(jié)構(gòu)的金屬蛋白酶，具有水解多肽鏈的氨基末端切掉二肽的肽酶。DPPIII在生理功能 上與腦啡肽和血管緊張素 II、血管緊張素 III、促黑色素等重要的生理活性肽的新陳代謝 有關(guān)。DPPsS在于各種哺乳動物的組織中，根據(jù)亞細(xì)胞的定位、特異性地?zé)o核抑制劑的敏 感性，二肽基肽酶分成不同的類型DPP I~DPP IV。DPP III可以選擇性地從多肽鏈或蛋 白質(zhì)的N-末端水解掉二肽殘基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。大鼠來源的DPP III由738個氨基酸組成，鋅離子是其催化金屬離子。其氨基酸序列與黃曲霉毒素單加氧酶 (Aflatoxin monooxygenas，AFM0)有55. 54%的同源性，但不具有對6-甲氧基雙咲喃香豆 素氧化分解的功能。
[0003] 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的劇毒性次生代謝產(chǎn)物，已經(jīng) 確定的黃曲霉毒素分子的結(jié)構(gòu)主要有八種，其中毒性最強的黃曲霉毒素 Bl (也稱6-甲氧 基雙呋喃香豆素）被認(rèn)為是潛在的對人類危害極為突出的一類強致癌誘變劑，一次大量攝 入會引起人及動物的急性中毒、甚至死亡；小劑量長期攝入會致畸、致突變和致癌，即使幾 十PPb的含量仍有極大的毒性；I族黃曲霉毒素含有呋喃雙鍵結(jié)構(gòu)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對 6-甲氧基雙呋喃香豆素具有分解作用的生物酶極少。黃曲霉毒素單加氧酶（AFMO)是一個 對6-甲氧基雙呋喃香豆素有氧化分解作用的酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素單加氧酶氧化分 解6-甲氧基雙呋喃香豆素的過程為：從底物分子中獲得電子傳遞給氧，使水還原成過氧化 氫，將底物氧化并進(jìn)一步使分子中的呋喃雙鍵開環(huán)。在這個過程中，由分子內(nèi)的變價離子的 價態(tài)變化來實現(xiàn)電子的傳遞，首先，結(jié)合在AFMO上的二價金屬離子奪得底物的一個電子， 自身變成一價離子，然后不穩(wěn)定的一價離子將奪得的這個電子傳遞給氧，自身又轉(zhuǎn)變成穩(wěn) 定的二價離子，氧氣分子獲得一個電子在水分子的參與下生成過氧化氫，同時底物轉(zhuǎn)變?yōu)?它的環(huán)氧化物。然后，該環(huán)氧化物伴隨著過氧化氫的作用發(fā)生氧化水解反應(yīng)，最終使底物分 子中的呋喃雙鍵斷開。黃曲霉毒素單加氧酶是目前已報道的用于黃曲霉毒素解毒的生物 酶。因此，發(fā)現(xiàn)和制造新的對6-甲氧基雙呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶，對發(fā)展黃曲 霉毒素消減技術(shù)具有十分重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的是提供一種定點突變的大鼠二肽基肽酶III，該大鼠二肽基肽 酶III突變體對6-甲氧基雙呋喃香豆素具有氧化分解功能。
[0005] 本發(fā)明所述的一種定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III是由氨基酸序列為SEQ ID NO. 1的來源于Rattus norvegicus的大鼠二肽基肽酶III(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號為D89340. 2) 中制造多個氨基酸取代而產(chǎn)生的、對6-甲氧基雙呋喃香豆素有氧化分解作用的大鼠二肽 基肽酶III突變體，所述的氨基酸取代包括第560、562和564位的取代。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III的進(jìn)一步特征，所述第 560位的氨基酸取代是用丙氨酸（Alanine, Ala, A)取代谷氨酸（Glutamic acid, Glu, E);第 562位的氨基酸取代是用賴氨酸（Lysine，Lys, K)取代丙氨酸（Alanine, Ala, A);第564位 的氨基酸取代是用組氨酸（Histidine, His, Η)取代色氨酸（Tryptophan, Trp, W);所述的定 點突變改造的大鼠二肽基肽酶III突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
[0007] 本發(fā)明所述的作用于6-甲氧基雙呋喃香豆素的大鼠二肽基肽酶III突變體 (ratDPP)，具有了 6-甲氧基雙呋喃香豆素的氧化分解功能。該突變體酶在pH6. 0,反應(yīng)溫度 25°C處理6-甲氧基雙呋喃香豆素（IOOppb) 50分鐘后，其對6-甲氧基雙呋喃香豆素的氧化 分解效率達(dá)到91. 3%。其余酶學(xué)性質(zhì)與野生酶相似。
[0008] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種DNA分子，其編碼本發(fā)明所述的定點突變改造的大 鼠二肽基肽酶III。
[0009] 優(yōu)選地，本發(fā)明所述的DNA分子的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種載體，其含有本發(fā)明所述的DNA分子。
[0011] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明所述的DNA分子，或者 含有本發(fā)明所述的載體。
[0012] 上述載體和宿主細(xì)胞都可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)手段進(jìn)行制備。
[0013] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III的生產(chǎn)方法， 包括：在適于二肽基肽酶III表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分 離所述的大鼠二肽基肽酶III。
[0014] 當(dāng)本發(fā)明所述的DNA分子以合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體或者 轉(zhuǎn)入所述的宿主細(xì)胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。許多 宿主-載體系統(tǒng)都可以用來表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于：用噬菌 體、質(zhì)?；蛘沉＾D(zhuǎn)化的細(xì)菌；含有大鼠載體的微生物，如大鼠；用病毒感染的哺乳動物細(xì)胞 系統(tǒng)；用病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用細(xì)菌感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選的載體包括 病毒載體、質(zhì)粒、粘?；蛘吖押塑账?。
[0015] 本發(fā)明優(yōu)選的宿主為真核系統(tǒng)如畢赤大鼠；本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)表達(dá)方法為畢赤 大鼠甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。
[0016] 本發(fā)明人成功地獲得了一種定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III，通過活性鑒定 實驗，證明該二肽基肽酶III突變體具有野生型二肽基肽酶III所不具備的氧化分解6-甲 氧基雙呋喃香豆素的生物活性，且該生物活性達(dá)到了應(yīng)用于飼料及其添加劑加工、食品及 其添加劑加工以及藥物開發(fā)的程度。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供將所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III在制備 飼料及其添加劑或食品及其添加劑中消除6-甲氧基雙呋喃香豆素的產(chǎn)品的應(yīng)用。結(jié)合目 前的飼料和食品的加工工藝，可將本發(fā)明所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III作為 脫毒劑添加到飼料中進(jìn)行飼料脫毒，或者制成固定化酶用于如花生油等食品的脫毒，或制 成能夠表達(dá)該酶的益生菌制劑或益生菌微囊等用于食品、糧油、飼料等的脫毒。
[0018] 本發(fā)明的另一目的是提供將所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III在制備 預(yù)防由6-甲氧基雙呋喃香豆素誘發(fā)的疾病的藥物的應(yīng)用。結(jié)合目前的常規(guī)藥物制備工藝， 可用本發(fā)明所述的定點突變改造的大鼠二肽基肽酶III制得到用于預(yù)防由6-甲氧基雙呋 喃香豆素誘發(fā)的疾?。ɡ缒[瘤）的藥物。
【附圖說明】
[0019] 圖1為重組質(zhì)粒ratDPP表達(dá)質(zhì)粒的鑒定圖。
[0020] 圖2為重組ratDPP和重組WtrDPP的純化結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021] 本文中所采用的術(shù)語，除非另有說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。以 下提供在本發(fā)明中使用的一些特殊術(shù)語的定義。
[0022] "wtrDPP"表示野生型大鼠二肽基肽酶III，其基因以斜體WtrDPP表示。
[0023] "ratDPP"表示突變體大鼠二肽基肽酶III，其基因以斜體ratDPP表示。
[0024] 實施例1 :wtrDPP和ratDPP的合成
[0025] 本發(fā)明以Rattus norvegicus的二肽基肽酶基因（NCBI數(shù)據(jù)庫D89340. 2)序列作 為參考，在 5' 端加入 5' -GTCGAATTC-3' 在 3' 端加入 3' -CCTAGGGAC-5'，(GAATTC)為限制 酶切位點EcoRI，(GGATCC)為限制酶切位點BamHI。采用人工全合成的方法合成wtrDPP基 因。
[0026] 本發(fā)明以Rattus norvegicus的二肽基肽酶基因（D89340. 2)序列作為參考， 將第560位的氨基酸用丙氨酸（Alanine，ALa, A)取代，第562位的氨基酸用賴氨酸 (Lysine，Lys，K)取代，第564位的氨基酸用組氨酸（Histidine，His，H)取代，在5'端加 入 5' -GTCGAATTC-3' 在 3' 端加入 3' -CCTAGGGAC-5'，(GAATTC)為限制酶切位點 EcoRI， (GGATCC)為限制酶切位點BamHI。采用人工全合成的方法合成ratDPP目的基因。
[0027] 在定點突變改造后，第560位的丙氨酸（Alanine，ALa，A)、第562位的賴氨 酸（Lysine，Lys, K)、第564位的組氨酸（Histidine, His, H)與第566位的谷氨酰 胺（Glutamine, Gin, Q)、第 568 位的組氨酸（Histidine, His, H)、第 569 位的甲硫氨 酸（Methionine, Met, M)、第 570 位的谷氨酰胺（Glutamine, Gin, Q)、第 571 位的丙氨酸 (Alanine，ALa, A)以及第 572 位的精氨酸（Arginine，Arg, R)形成一個 AXKXHXQXHMQAR(A 為丙氨酸，K為賴氨酸，H為組氨酸，X為任意氨基酸）序列。
[0028] 基因合成由商業(yè)性公司（例如上海捷瑞生物有限公司）完成。
[0029] 實施例2 :重組質(zhì)粒WtrDPP和ratDPP表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0030] 基因克隆按常規(guī)方法（Sambrook, et al. 2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)進(jìn)行，將實施例 1 所得的 wtrDPP和ratDPP分別克隆到pHIL-Sl構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pHIL-Sl-wtrDPP和表達(dá)質(zhì)粒 pHIL-Sl-ratDPP，克隆后的目的基因經(jīng)酶切、測序鑒定。
[0031] 具體做法：
[0032] 含ratDPP的重組質(zhì)粒pHIL-Sl的構(gòu)建過程為：EcoRI+BamHI雙酶切質(zhì)粒pHIL-Sl 和目的片斷ratDPP，酶切產(chǎn)物進(jìn)行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收。利用T4 DNA連接酶 進(jìn)行質(zhì)粒PHIL-Sl和ratDPP的連接。CaCl2法制備E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，堿提質(zhì)粒。用EcoRI+BamHI、Hind III、SacI酶切鑒定重組質(zhì)粒 pHIL-Sl-ratDPP。挑取重組質(zhì)粒 PEG 純化法（Sambrook，et al. 2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)提取質(zhì)粒 DNA〇 以 T7和SP6為測序引物，采用DNA自動序列儀，正反向進(jìn)行測定。酶切結(jié)果如圖I示，重組載 體？!111^-31-抑七0??的酶切鑒定，8 &111!114(3〇1?1雙酶切（樣品1)切下一條帶位于210(^?左 右，HindIII單酶切（樣品2)，SacI單酶切（樣品3)。
[0033] 含WtrDPP的重組質(zhì)粒pHIL-Sl的構(gòu)建過程為：將含ratDPP的重組質(zhì)粒pHIL-Sl 的構(gòu)建過程中的目的片斷ratDPP替換為wtrDPP，其他操作過程與含ratDPP的重組質(zhì)粒 pHIL-Sl的構(gòu)建過程相同。
[0034] 實施例3 :重組ratDPP和重組WtrDPP的表達(dá)
[0035] 重組ratDPP的表達(dá)：用SacI酶切重組質(zhì)粒pHIL-Sl-ratDPP和質(zhì)粒pHIL-Sl，酶 切產(chǎn)物進(jìn)行〇. 8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切后的線性重組