Tmem176a基因啟動子區(qū)dna甲基化檢測的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及甲基化檢測技術(shù)，具體來說涉及到TMEM176A基因啟動子區(qū)DNA甲基化 檢測，特別是一種用于檢測TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的甲基化引物對，進一步包 括非甲基化引物對。同時，本發(fā)明還涉及含有所述引物對的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是全世界范圍內(nèi)致死率最高的惡性腫瘤之一，在常見腫瘤中排第八位，在 消化道腫瘤中排第四位。盡管隨著臨床腫瘤學(xué)的不斷發(fā)展進步，食管癌仍然是癌癥相關(guān)死 亡率最主要的原因之一。食管癌主要包括食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌兩種，其發(fā)病率有很 大的地區(qū)差異，高發(fā)地帶主要有非洲南部和東部、亞洲中部和東部，從伊朗北部到中亞共和 國一直延伸到中國北部和中部被稱為"食管癌帶"，男女發(fā)病無差異。據(jù)統(tǒng)計，僅2012年就 有456000例新發(fā)食管癌患者，有400000例食管癌患者死亡。中國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，其 發(fā)病率和死亡率分別為22. 4/100000和16. 77/100000,90%為食管鱗狀細(xì)胞癌，主要與吸 煙、飲酒、營養(yǎng)狀況差、蔬菜和水果攝入量少以及進食過燙的食物有關(guān)。食管腺癌主要在西 方發(fā)達國家較常見，主要與胃食管反流病、巴雷特食管、吸煙、肥胖、果蔬攝入少以及幽門螺 旋桿菌感染史相關(guān)。食管癌的整體預(yù)后較差，5年生存率不超過20%。早期食管癌一般是無 癥狀的，但是，隨著內(nèi)鏡診斷技術(shù)的不斷改進，使得早期食管癌的胃鏡檢出率提高了。吞咽 困難是中晚期食管癌最常見的癥狀，可伴隨體重下降。胃鏡檢查雖然能夠較直觀的觀察食 管粘膜病變，但最終確診還是依賴于胃鏡下胃組織的病理活檢及切除標(biāo)本的病理診斷。食 管癌目前的治療主要包括單純外科手術(shù)、外科手術(shù)聯(lián)合化療、放療或放化療，其5年生存率 依次為16% -52%、23% -36%、18. 6% -41. 3%、39%;對于不能切除的食管癌，以單純放化 療為主，但對維持癥狀緩解率、改善長期生存率的效果非常有限，因此，食管癌的預(yù)后不良。
[0003] 結(jié)直腸癌是世界第三大惡性腫瘤，在世界惡性腫瘤相關(guān)死亡病因中排名第四。每 年大約有120萬新發(fā)病例被診斷為結(jié)直腸癌，60萬病例死于結(jié)直腸癌。在男性患者常見腫 瘤中，結(jié)直腸癌居第三位，而在女性患者中居第二位。根據(jù)美國癌癥協(xié)會（American Cancer Society，ACS) 2014公布的權(quán)威數(shù)據(jù)表明結(jié)直腸癌是美國男性和女性總第三大最常見的癌 癥和第三大癌癥死亡原因，近20年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率呈明顯下降趨勢。而我 國2014年公布的最新數(shù)據(jù)表明男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在肺癌、胃癌、肝癌及食管 癌之后，位列第5。女性結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率居于乳腺癌、肺癌之后，為第3。全國腫 瘤登記中心在2011年和2013年收集全國登記處腫瘤登記資料，分析2003-2007年和2009 年全國腫瘤登記覆蓋地區(qū)癌癥的發(fā)病和死亡水平，結(jié)果顯示2003~2007年中國結(jié)直腸癌 發(fā)病率為28. 08/10萬；癌死亡率為13. 41/10萬。2009年中國結(jié)直腸癌發(fā)病率為29. 44/10 萬；癌死亡率為14. 23/10萬。由此可見我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，應(yīng)加強 結(jié)直腸癌的綜合防治工作，提高結(jié)直腸癌的早診早治水平。
[0004] 鑒于目前應(yīng)用于臨床的食管癌和結(jié)直腸癌的診斷和治療手段，尤其是對腫瘤的早 期診斷、殘留病灶及復(fù)發(fā)的檢測方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問題。因此，發(fā) 現(xiàn)食管癌和結(jié)直腸癌的早期診斷和治療的有效方法具有十分重要的意義。
[0005] 隨著后基因組時代的到來，表觀遺傳學(xué)（Epigenetics)已成為生命學(xué)科的研究前 沿。表觀遺傳學(xué)是針對遺傳學(xué)而言的，是指研究DNA序列不發(fā)生改變的可遺傳的基因表達 變化的科學(xué)，它可以解釋一些經(jīng)典遺傳學(xué)所不能解釋的問題，例如：單卵雙生的兄弟具有完 全相同的基因型，并在同樣的環(huán)境下成長，但僅其中一人患胃癌，而另外一人身體健康，因 此表觀遺傳信息提供了何時、何地以何種方式去應(yīng)用遺傳信息的指令。在消化系腫瘤領(lǐng)域 中，表觀遺傳學(xué)研究主要集中DNA甲基化及組蛋白乙?；?。DNA甲基化修飾是基因組表 觀遺傳調(diào)控中主要的方式，人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，基因啟動子區(qū) CpG島高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達沉默進而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。DNA甲基化是指在甲基化轉(zhuǎn) 移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到CG二核苷酸胞嘧啶的5號 碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化異常是細(xì)胞癌變過程中早期、頻發(fā)事件，因此特 異基因的甲基化可作為癌癥早期診斷的分子標(biāo)志物、治療靶點和判斷預(yù)后手段。隨著技術(shù) 的進步，檢測甲基化的手段也豐富起來，不僅可探測某段DNA序列的甲基化分布，而且還能 大通量的了解整個基因組的甲基化程度。目前主要方法有兩類：一是亞硫酸氫鈉法（Sodium Bisulfite)，包括亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法、亞硫酸氫鈉聯(lián)合限制性內(nèi)切酶分析法 (C0BRA)、甲基化特異性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的單核苷酸擴增法（Ms-SNuE)等；另一類 是甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性圖譜（MSRF)、限 制性標(biāo)記基因組掃描技術(shù)（RLGS)、差異性甲基化雜交分析（DMH)、甲基化CpG島擴增子分析 (MCA)等。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman發(fā)明了此項技術(shù)后，大大簡化了 DNA甲 基化的檢測方法，使得表觀遺傳學(xué)研究更加迅速的向前發(fā)展，其突出的優(yōu)點在于高特異性、 高靈敏度、操作簡便、費用及耗時均較少、不受限制性內(nèi)切酶的限制，目前MS-PCR已成為用 以研究基因甲基化狀態(tài)的應(yīng)用最為廣泛的方法，尤其對于大批的臨床標(biāo)本甲基化狀態(tài)的 研究更是首選方法。MS-PCR的基本原理是：DNA經(jīng)過亞硫酸鹽硫化修飾后，CpG島上沒有發(fā) 生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，最后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，而發(fā)生甲基化 的胞嘧啶則保持不變，因此針對上述區(qū)別分別設(shè)計甲基化引物及非甲基化引物，分別進行 PCR擴增，擴增產(chǎn)物行凝膠電泳照相觀察結(jié)果，得出是否為甲基化的結(jié)論。
[0006] 跨膜蛋白 176 (transmembrane protein 176, TMEM176)是與跨膜蛋白 4A 家族 (membrane-spanning 4A family of protein，MS4A)相關(guān)的蛋白，存在于哺乳動物和骨魚 類，包括TMEM176A和176B兩種亞型。ZuccoIo等在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了大量的高度保守的 TMEM176基因。TMEM176A最早是在小鼠的腎臟近端小管細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，位于6號染色體。而 人類TMEM176A基因位于7q36. 1，有四個跨膜結(jié)構(gòu)域，最早是在肝細(xì)胞癌中篩選腫瘤相關(guān)抗 原發(fā)現(xiàn)的。Gehrau等發(fā)現(xiàn)當(dāng)肝移植患者復(fù)發(fā)丙型肝炎感染時，TMEM176A的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明 顯增加。Condamine等研究發(fā)現(xiàn)TMEM176A與176B是相互作用的，二者在維持小鼠幼稚樹突 狀細(xì)胞的未成熟狀態(tài)中起著重要作用，炎癥刺激使TMEM176A和176B表達下調(diào)。Cuajungco 等發(fā)現(xiàn)TMEMl76A與176B在人類很多組織中都有明顯的表達，在淋巴瘤和肺癌中，TMEMl76A 的蛋白水平表達明顯增加。Strelnikov等報道人類TMEM176A和176B的CpG島異常的DNA 甲基化與乳腺癌有關(guān)。綜上所述，目前對TMEM176A的功能研究還存在很多的不足，其在食 管癌的表觀遺傳學(xué)改變和功能研究尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，即用 于檢測TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物，同時，本發(fā)明另一目的是提供一種含有 所述引物的試劑盒。本發(fā)明的又一目的是提供一種檢測TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化狀 態(tài)的方法，以此來對食管癌、結(jié)直腸癌進行風(fēng)險評估。
[0008] 經(jīng)過反復(fù)的試驗與推敲，本發(fā)明人選出一對特異性很好的甲基化引物對及非甲基 化引物對，并且建立了一個穩(wěn)定的反應(yīng)體系，摸索出理想的反應(yīng)條件，應(yīng)用敏感度較高的丙 烯酰胺凝膠電泳技術(shù)作為結(jié)果的檢出手段，因此得出可靠的實驗結(jié)果，結(jié)果表明：TMEM176A 基因啟動子區(qū)的高甲基化狀態(tài)在食管癌和結(jié)直腸癌中具有較高的特異性。利用所述引物 對及試劑盒檢測TMEM176A基因甲基化狀態(tài)的靈敏度高，解決了上述檢出率低、結(jié)果難以分 析、僅能顯示大體的基因?qū)W異常等一系列技術(shù)問題，因此，本發(fā)明所述的引物及試劑盒可用 于食管癌和結(jié)直腸癌的早期診斷、療效判定等。
[0009] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：用于檢測細(xì)胞TMEM176A基因啟動子區(qū)甲基化 狀態(tài)的引物對，其為甲基化引物，其上游引物核苷酸序列如Primer-MF所述，即： 5' GAAGAAAGACGTTTTGTGGATAGGAC 3'，下游引物核苷酸序列如 Primer-MR 所述，艮P : 5' CTAATATCCGCTCTACTCGACCGCG 3'。利用該甲基化引物對，以硫化修飾后的DNA為模板進 行MS-PCR擴增。如果TMEM176A基因啟動子區(qū)存在甲基化，則會得到156bp大小的片段； 如果TMEM176A基因正常即未甲基化，則不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物?；诖?，本申請將該引物對稱為 甲基化引物。所述甲基化引物對，其上游引物的Tm 59. 17, GC含量42%，下游引物的Tm 63. 86, GC 含量 56%。
[0010] 本發(fā)明還涉及下述非甲基化引物對，其上游引物核苷酸序列如Primer-UF所述， 艮P :5' GGAAGAAAGATGTTTTGTGGATAGGAT 3'，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述，即： 5' CAACTAATATCCACTCTACTCAACCACA 3'。利用該非甲基化引物對，以硫化修飾后的DNA為 模板進行MS-PCR擴增，如果TMEM176A基因正常即未甲基化，則會得到160bp大小的片段。 基于此，本申請將該引物對稱為非甲基化引物。所述非甲基化引物對，其上游引物的Tm 57. 86, GC含量37%，下游引物的Tm 59. 58, GC含量39%。
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