一種生乳細(xì)菌總數(shù)熒光定量pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品衛(wèi)生微生物快檢速驗(yàn)領(lǐng)域，尤其是指一種生乳細(xì)菌總數(shù)熒光定量PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生乳中的細(xì)菌數(shù)量直接關(guān)系到其是否可以作為原料乳進(jìn)行各種乳制品的后續(xù)加工。GB19301-2010規(guī)定，當(dāng)生乳中的細(xì)菌總數(shù)超過2X 106CFU/g(mL)時(shí)，生乳的質(zhì)量安全就會受到影響，超過這個限值的鮮乳是不允許用作原料乳的。
[0003]目前乳品企業(yè)常用的檢測生乳細(xì)菌數(shù)量的方法是國標(biāo)法(平板培養(yǎng)法)和儀器檢測法。國標(biāo)法檢測時(shí)間需2-3d，且只能檢測出在特定培養(yǎng)條件下生長的細(xì)菌，因此，常存在漏檢的可能，不適應(yīng)鮮乳加工企業(yè)的生產(chǎn)要求；儀器檢測方法快速、準(zhǔn)確，但是檢測成本較尚ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種生乳細(xì)菌總數(shù)熒光定量PCR檢測方法，以解決目前常用的檢測方法存在漏檢、或是檢測成本較高的問題。
[0005]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，包括下列步驟:
(一)分離鑒定生乳中細(xì)菌種類，并確定污染菌譜包括以下13株菌:格式乳球菌、中間葡萄球菌、血鏈球菌、克氏庫克菌、陰溝腸桿菌、溶血性葡萄球菌、大腸埃希菌、蜂房哈夫尼亞菌、阪崎腸桿菌、綠淺氣球菌、雷根斯堡約克氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯菌；
(二)分析污染菌譜中細(xì)菌序列，并設(shè)計(jì)16SrRNA通用引物:
引物 1:5’ -GCCACTCCTCAAGGGAACAA-3’
引物 2:5’ -TGACGCTCAGGTGCGAAAG-3’
(三)生乳樣品前處理方法:取lmL行乳，12000g/min離心5min，棄掉上層脂肪與上清，無菌生理鹽水洗兩次，12000g/mL離心2min，無菌水重懸下層沉淀，100°C沸水浴30min提取細(xì)菌DNA，同時(shí)采用國標(biāo)法計(jì)數(shù)加標(biāo)樣品細(xì)菌總數(shù)；
(四)以步驟(三)得到的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng):
20 yL 反應(yīng)體系包括:Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μ L，上、下游引物各0.5 μ L，去離子水8 μ L，模板DNA 1 μ L ；
反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性10 min，95°C變性30 s，59 °C，退火50 s，72 °C延伸30 s，40個循環(huán)；
(五)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
建立細(xì)菌常見污染菌譜中13種菌的細(xì)菌濃度(logCFU/mL)與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析不同細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定細(xì)菌濃度為2 X 106 CFU/mL時(shí)對應(yīng)的CT值，污染菌譜中蜂房哈弗尼亞菌CT值最低為:29.4，溶血性葡萄球菌CT值最高為:32.7 ;當(dāng)檢測樣品的(^值> 32.7時(shí)，樣品為合格產(chǎn)品，可作為生乳；當(dāng)CT值〈29.4時(shí)，細(xì)菌總數(shù)超過2\106 CFU/mL，樣品為不合格產(chǎn)品；介于范圍內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)2X 106 CFU/mL不應(yīng)作為低溫乳品的原料。
[0006]熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高、且沒有繁瑣的產(chǎn)物后處理過程，是目前定量核酸濃度的首選技術(shù)。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，定量生乳樣品中細(xì)菌16SrDNA，針對污染菌譜中不同菌株建立細(xì)菌濃度(國標(biāo)法計(jì)數(shù))與熒光定量PCR的CT值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析不同菌株濃度為2X 106CFU/g(mL)時(shí)其標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)CT值，確定CT值范圍，在以期根據(jù)CT值判斷鮮乳中的細(xì)菌是否超標(biāo)，完成對鮮乳的質(zhì)量等級的確定。
[0007]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是，使用本方法的準(zhǔn)確率在90%以上，檢測時(shí)間在4 h左右，是一種快速檢測鮮乳細(xì)菌總數(shù)的新方法，能夠?yàn)轷r乳樣品的質(zhì)量等級進(jìn)行快速的確定。利用本發(fā)明檢測方法以吉林省廣澤牧場采集500份鮮乳樣品，分離鑒定污染細(xì)菌，確定污染菌譜，針對該污染菌譜設(shè)計(jì)一對16S rDNA通用引物，PCR擴(kuò)增片段長度為293bp。得到了該區(qū)域牧場鮮乳細(xì)菌數(shù)量超標(biāo)的參考CT值范圍:相同細(xì)菌濃度的人工加標(biāo)污染牛奶樣品的CT值范圍為29.4-32.7對100份實(shí)際鮮乳樣品同時(shí)運(yùn)用國標(biāo)法和熒光定量PCR法檢測，驗(yàn)證熒光定量PCR方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，人工加標(biāo)污染牛奶樣品所得的CT值范圍可作為實(shí)際鮮乳樣品細(xì)菌是否超標(biāo)的參考范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0008]包括下列步驟:
(一)分離鑒定生乳中細(xì)菌種類，并確定污染菌譜包括以下13株菌:格式乳球菌、中間葡萄球菌、血鏈球菌、克氏庫克菌、陰溝腸桿菌、溶血性葡萄球菌、大腸埃希菌、蜂房哈夫尼亞菌、阪崎腸桿菌、綠淺氣球菌、雷根斯堡約克氏菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯菌；
(二)分析污染菌譜中細(xì)菌序列，并設(shè)計(jì)16SrRNA通用引物:
引物 1:5’ -GCCACTCCTCAAGGGAACAA-3’
引物 2:5’ -TGACGCTCAGGTGCGAAAG-3’
(三)生乳樣品前處理方法:取lmL生乳，12000g/min離心5min，棄掉上層脂肪與上清，無菌生理鹽水洗兩次，12000g/mL離心2min，無菌水重懸下層沉淀，100°C沸水浴30min提取細(xì)菌DNA，同時(shí)采用國標(biāo)法計(jì)數(shù)加標(biāo)樣品細(xì)菌總數(shù)；
(四)以步驟(三)得到的DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng):
20 yL 反應(yīng)體系包括:Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μ L，上、下游引物各0.5 μ L，去離子水8 μ L，模板DNA 1 μ L ；
反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性10 min，95°C變性30 s，59 °C，退火50 s，72 °C延伸30 s，40個循環(huán)；
(五)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
建立細(xì)菌常見污染菌譜中13種菌的細(xì)菌濃度(logCFU/mL)與CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析不同細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定細(xì)菌濃度為2 X 106 CFU/mL時(shí)對應(yīng)的CT值，污染菌譜中蜂房哈弗尼亞菌CT值最低為:29.4，溶血性葡萄球菌CT值最高為:32.7 ;當(dāng)檢測樣品的(^值> 32.7時(shí)，樣品為合格產(chǎn)品，可作為生乳；當(dāng)CT值〈29.4時(shí)，細(xì)菌總數(shù)超過2\106 CFU/mL，樣品為不合格產(chǎn)品；介于范圍內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)2X 106 CFU/mL不應(yīng)作為低溫乳品的原料。
[0009]應(yīng)用例:
對吉林省污染生乳的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，以分析本地區(qū)生乳污染情況，為建立針對性檢測生乳中的污染細(xì)菌提供參考。采集吉林省部分地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場及農(nóng)戶散養(yǎng)奶牛自產(chǎn)生乳，采用常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行分離培養(yǎng)。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，對PCR產(chǎn)物測序、分析，與Genbank上已知的細(xì)菌16S rDNA序列對比同源性，交叉同源性較高的細(xì)菌進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)加以補(bǔ)充鑒定。結(jié)果顯示，主要污染鮮乳的細(xì)菌有:格式乳球菌、血鏈球菌、中間葡萄球菌、克氏庫克菌、溶血性葡萄球菌、陰溝腸桿菌、雷根斯堡約克氏菌、蜂房哈夫尼亞菌、大腸埃希菌、阪崎腸桿菌，綠淺氣球菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯菌。
[0010]引物設(shè)計(jì)與通用性檢測
用DNAMAN軟件分析乳品常見污染細(xì)菌的16S rDNA序列，根據(jù)序列的保守