此，可以使用合適的緩沖劑，例如HEPES、磷酸鉀、MOPS、TEA或TRIS-HC1。
[0045] 優(yōu)選的溫度范圍為25°C，然而該反應也可以在20°C - 30°C下很好進行。
[0046] 優(yōu)選在大氣壓下進行該反應。
[0047] 替代地，可以用該（5)選擇性轉(zhuǎn)氨酶在體內(nèi)進行該酶促反應。
[0048] 為此，可以使用大腸桿菌作為生產(chǎn)生物體。
[0049] 在此可以將為轉(zhuǎn)氨酶編碼的基因連接到媒介物中。
[0050] 該大腸桿菌菌種優(yōu)選為重組的，并含有攜帶用于（5)_選擇性轉(zhuǎn)氨酶的基因的質(zhì) 粒。
[0051] 該質(zhì)粒優(yōu)選可以包含用于上述轉(zhuǎn)氨酶的基因。
[0052] 例如可以使用包含相應的轉(zhuǎn)氨酶基因的pET29a或ρΚΚ233-基體作為質(zhì)粒。
[0053] 該生產(chǎn)生物體將所希望的式（3)的產(chǎn)物分泌到水溶液中。
[0054] 可以在本發(fā)明的方法中在體內(nèi)僅對于第一或者第二反應步驟或者對于反應步驟1 和2兩者進行反應。對于各個步驟，可以正如對于體外酶促反應那樣選擇其余條件。
[0055] 圖4展示了圖1和3的步驟的總結(jié)。
[0056] 實施例: 通過在第一步驟中的來自生物體巴氏醋酸桿菌的（5)-選擇性裂解酶ApH)C-E469G和 在第二步驟中的來自生物體紫色色桿菌的（5)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶CV2025的組合，成功進行了 該2-步合成。在第一步驟中，以約70 %的對映異構(gòu)體純度使乙醛直接與苯甲醛或使丙酮 酸在脫羧成為乙醛之后與苯甲醛連接形成（5)_PAC。在后處理之后的產(chǎn)率為95 %，從為約 70 %。在第二反應步驟中的產(chǎn)率為95 %。總之，可是如此通過這兩個反應步驟產(chǎn)生約90 % 的形成去甲偽麻黃堿的總轉(zhuǎn)化率與ee > 99 %和也約為70 %的光學純度。
[0057] 反應條件: 步驟1 (裂解酶-反應，圖1): 40mM苯甲醛、400 mM丙酮酸、2. 5 mM硫酸鎂、100 Mm二磷酸硫胺素、0. 5 mg/mL ApH)C-E469G (提純的親脂化的酶)、100 mM磷酸鉀-緩沖劑，25°C，反應時間48h。隨后進 行萃取和柱色譜提純產(chǎn)物（（5)-PAC)。產(chǎn)率為95 %。替代地，也可以用乙醛代替丙酮酸進 行該反應，和/或用整個細胞代替提純的酶進行該反應，在該整個細胞中酶AproC-E469G過 表達地存在。
[0058] 步驟2 (轉(zhuǎn)氨酶反應，圖3) IOmM (5)-PACUOmM (5) - α -甲基芐胺、I mg/ml 提純的酶，25 °C，100 mM HEPES 與 0.1 mM 5^磷酸吡哆醛，pH 7. 5,反應時間24 h。轉(zhuǎn)化率為95 %。替代地，也可以用親脂化 的整個細胞催化該反應，其中該（5)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶過表達地存在。
[0059] 通過該裂解酶反應之后的額外步驟，可以任選地提高中間體（（5)-PAC)的對映異 構(gòu)體純度。向提純的（5)_PAC (⑶約70%)中添加丙酮酸、ApH)C-E469G和來自生物體熒光 假單胞菌的苯甲醛裂解酶。該苯甲醛裂解酶催化由（R)-PAC形成苯甲醛和乙醛的選擇性裂 解反應。所產(chǎn)生的苯甲醛類似于反應步驟1用作底物，該底物用于接著由酶ApH)C-E469G 催化苯甲醛和丙酮酸的碳連接反應（Carboligationsreaktion)以形成（S)-PAC。當苯甲醛 裂解酶和APFOC-E469G均存在于反應配方（Reaktionsansatz)中時，如此可以將產(chǎn)物的ee 提高到ee> 97 % (S)PAC。基于該步驟中所用PAC的總量計，產(chǎn)率為> 91 %。
[0060] 提高圖2中的（5)-PAC的對映異構(gòu)體純度： a) 11. 2 mM (5)-PAC (ee約 70%)、200 mM 丙酮酸、2. I mg/mL ApPDC-E469G、2 mg/mL BAL (苯甲醛裂解酶)、2. 5 mM硫酸鎂、100 μΜ二磷酸硫胺素、10〇μΜ磷酸鉀-緩沖劑，25°C， 反應時間：48h。產(chǎn)率：91. 6 %，ee ( (5)-PAC) = 97. 4 %〇 b) 20.7 mM (5)-PAC (ee約 70 %)、300 mM 丙酮酸、2. I mg/mL ApPDC-E469G、2 mg/mL BAL (苯甲醛裂解酶)、2. 5 mM硫酸鎂、100 μΜ二磷酸硫胺素、10〇μΜ磷酸鉀-緩沖劑，25°C， 反應時間 48 h。產(chǎn)率 93. 7 %，ee ( (5)-PAC) = 96. 7 %〇
【主權(quán)項】
1. 用于制備（1S2々-去甲偽麻黃堿的方法， 其特征在于，在第一反應步驟中借助（身-選擇性裂解酶使苯甲醒與式（1)的乙酷基給 體反應生成式（2)和（3)的對映異構(gòu)體混合物，并且在第二步驟中借助（々-選擇性轉(zhuǎn)氨酶使式（3)的化合物與胺給體反應生成 (1S2々-去甲偽麻黃堿。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法， 其特征在于， 在第一步驟中使用來自醋菌的裂解酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法， 其特征在于， 使用ApPDC-E469G作為裂解酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的方法， 其特征在于， 使用儀鹽W及二憐酸硫胺素作為輔因子。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項的方法， 其特征在于， 步驟1在5至9的抑-值下進行。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項的方法， 其特征在于， 借助苯甲醒裂解酶使作為所述第一反應步驟的產(chǎn)物的式（2)的化合 物反應生成苯甲醒和乙醒。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項的方法， 其特征在于， 過量添加所述乙酷基給體。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項的方法， 其特征在于， 分離式（3)'的中間產(chǎn)物。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的方法， 其特征在于， 在第二步驟中用來自色桿菌、反硝化產(chǎn)堿菌、巧樣節(jié)桿菌、巨大芽抱桿菌、巧光假單胞 菌、河弧菌或新月柄桿菌的（々-選擇性轉(zhuǎn)氨酶使式（3)^的化合物反應。10. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法， 其特征在于，使用CV2025作為（々-選擇性轉(zhuǎn)氨酶。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項的方法， 其特征在于， 在第二步驟中使用選自甲基節(jié)胺、節(jié)胺、異丙胺、k丙氨酸、（±)-1-甲基-3苯基丙胺 或（±)-1-氨基巧滿的組分作為胺給體。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項的方法， 其特征在于， 在步驟2中使用5'-憐酸化唉醒作為輔因子。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項的方法， 其特征在于， 步驟2在6至11的抑-值下進行。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項的方法， 其特征在于， 在所述步驟1和/或2中使用提純和親脂化的酶。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項的方法， 其特征在于， 所述步驟1和/或2在體內(nèi)進行。16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法， 其特征在于， 使用大腸桿菌作為生產(chǎn)菌種。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法， 其特征在于，使為所述裂解酶和/或轉(zhuǎn)氨酶編碼的基因連接到所述載體中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于制備去甲偽麻黃堿（(1<i>S</i>,2<i>S</i>)–去甲偽麻黃堿）的方法，其中在第一反應步驟中借助(<i>S</i>)-選擇性裂解酶使苯甲醛與式(1)的乙?；o體反應生成式(2)和(3)的對映異構(gòu)體混合物，，并且在第二步驟中借助(<i>S</i>)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶使式(3)的化合物與胺給體反應生成(1<i>S</i>,2<i>S</i>)–去甲偽麻黃堿。
【IPC分類】C12P13/00, C12P7/26
【公開號】CN105408489
【申請?zhí)枴緾N201480032090
【發(fā)明人】D.羅特爾, M.波爾, T.澤爾, A.G.巴賴巴
【申請人】于利奇研究中心有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2014年5月17日
【公告號】DE102013009631A1, EP3008198A1, US20160138062, WO2014198247A1