G2人肝癌細(xì)胞株購自中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。L02正常人肝細(xì) 胞株由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所饋贈(zèng)。化合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%。 RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司。標(biāo)準(zhǔn)小牛血清購自Biowest公司。3-(4, 5-二甲 基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（11'1')、二甲基亞砜（0130)、臺(tái)盼藍(lán)（1'巧?&1^1^6)、二氯 熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA)均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他常用試劑均為分 析純。
[0029] 微量天平（瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通臺(tái)式離心機(jī)（上海 安亭科學(xué)儀器廠）。數(shù)顯電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠，HH.W21.600S)。二氧 化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國FormaScientific公司）。高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司， IECMICROMAXRF)。超微量紫外分光光度計(jì)（美國ThermoHsher公司，NanoDrop-1000)。 紫外成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司，F(xiàn)R-200A)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，熒光分光光度計(jì) (HitachiF2500)。
[0030] 二、試驗(yàn)方法
[0031] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0032] 將細(xì)胞常規(guī)接種于含10% (體積分?jǐn)?shù)）小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% 0)2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033] 2、化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液的配置
[0034] 將45. 44mg化合物（I)溶于10mL二甲基亞砜（DMS0)制得儲(chǔ)備液并分別稀釋2 倍、4倍，分別得到2mmol/L、4mmol/L及8mmol/L的化合物（I)應(yīng)用液。進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)前， 將50μL應(yīng)用液與4950μL常規(guī)培養(yǎng)液（含10 %體積分?jǐn)?shù)的小牛血清）充分混合，得到化 合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液（20ymol/L、40ymol/L、80ymol/L)〇
[0035] 3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
[0036] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL(5X103細(xì)胞）。培養(yǎng)12h待 細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200μL不同濃度的化合物（I)培養(yǎng)液（DMS0溶解化合物 (I)后以1 %體積分?jǐn)?shù)與常規(guī)培養(yǎng)液混合，使化合物（I)終濃度為20μmol/L、40μmol/ L、80ymol/L)，每組6個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)6個(gè)溶劑（DMS0)對(duì)照孔。培養(yǎng)2處、4811、7211，每 24小時(shí)更換化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液。干預(yù)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，向各孔加入20μLMTT溶 液，37°C孵育4h后吸去各孔上清液，加入150μLDMSO,置搖床上低速震蕩lOmin，待結(jié)晶充 分溶解后，以DMS0調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率 (survivalrate，SR)。SR=實(shí)驗(yàn)組A49。/ 對(duì)照組A49QX100%
[0037] 4、臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定存活細(xì)胞數(shù)
[0038] 將相同數(shù)量（2X106)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時(shí)間待細(xì)胞貼壁后，棄 去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩遍后，加入5mL的化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液（20ym〇l/L、40ym〇l/ L、80ymol/L)。每組三瓶細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立三瓶溶劑（DMS0)對(duì)照。培養(yǎng)48h后，用0. 25%胰 酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞數(shù)。
[0039] 5、DCFH-DA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)R0S活性
[0040] 將相同數(shù)量（2X106)的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時(shí)間待細(xì)胞貼壁后， 吸去原培養(yǎng)液，加入5mL化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消 化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液于1. 5mLEP管中，1500rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入lmL DCFH-DA，吹打混勻，37°C孵育30min，加入PBS終止反應(yīng)，離心收集沉淀并溶解于lmLPBS， 吹打成均勻細(xì)胞懸液，用Hitachi-F2500焚光分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā) 射波長(zhǎng)525nm。
[0041] 三、結(jié)果及結(jié)論
[0042] 1、細(xì)胞生長(zhǎng)存活率
[0043] !fepG2細(xì)胞經(jīng)化合物（I)干預(yù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，低、中、高劑量組的細(xì)胞存活 率均顯著低于溶劑對(duì)照組（P〈〇. 05)，且細(xì)胞存活率下降的程度與化合物（I)干預(yù)濃度之 間存在一定劑量效應(yīng)趨勢(shì)（表l，aP〈〇. 05VS對(duì)照組；bP〈0. 05VS低劑量組；T〈0. 05VS中劑量 組）。在同一化合物（I)干預(yù)濃度下，細(xì)胞存活率隨著干預(yù)時(shí)間的增加而呈現(xiàn)下降的趨 勢(shì)。而同等條件下，L02人正常肝細(xì)胞經(jīng)化合物（I)干預(yù)后，細(xì)胞存活率無顯著變化（表 2)。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與MTT-致（圖3,aP〈0. 05VS對(duì)照組；bP〈0. 05VS低劑量組； CP〈0. 05VS中劑量組）。
[0044] 2、細(xì)胞內(nèi)R0S活性
[0045] HepG2人肝癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度化合物（I)干預(yù)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)R0S水 平顯著下降（p〈0. 05)。結(jié)果見表3 (aP〈0. 05VS對(duì)照組；bP〈0. 05VS低劑量組）。
[0046] 結(jié)論，采用不同濃度的化合物（I)對(duì)人肝癌細(xì)胞Η印G2進(jìn)行干預(yù)處理，經(jīng)MTT比 色及臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)表明，化合物（I)能夠有效抑制IfepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，干預(yù)組 細(xì)胞的存活率較對(duì)照組顯著降低，且降低程度與化合物（I)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨 勢(shì)，同時(shí)在同一化合物（I)濃度下，細(xì)胞存活率隨著干預(yù)時(shí)間的增加而呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨 勢(shì)。與此同時(shí)，相同劑量的化合物（I)干預(yù)對(duì)L02正常肝細(xì)胞并不產(chǎn)生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)對(duì)！fepG2細(xì)胞生長(zhǎng)存活率的影響（X土s，η= 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)對(duì)L02細(xì)胞生長(zhǎng)存活率的影響（x土s，η= 6)
[0050]
[0051] 表3化合物（I)對(duì)!fepG2細(xì)胞R0S水平的影響（x土s，η= 6)
[0052]
[0053] 實(shí)施例3
[0054] 片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0055] 實(shí)施例4
[0056] 口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0057] 實(shí)施例5
[0058] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0059] 實(shí)施例6
[0060] 注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0061] 實(shí)施例7
[0062] 無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌 熔封得粉針劑。
[0063] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I )，O2. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 馬齒莧的干燥地上部分粉碎，用75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，再用75 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫 物浸膏；（c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、45:1、 25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I )。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為DlOl 大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為80 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物 (I )和藥學(xué)上可接受的載體。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I )在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求5所述的藥物組合物在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的異香豆素類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的異香豆素類化合物，可以從馬齒莧的干燥地上部分中提取、分離純化得到。體外試驗(yàn)證明該化合物能夠有效抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，顯著降低細(xì)胞的存活率，且降低程度與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)趨勢(shì)，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥物。
【IPC分類】C07D307/00, A61K31/343, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105418545
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511023821
【發(fā)明人】吳金鳳
【申請(qǐng)人】吳金鳳
【公開日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日