。待溶解后再緩慢地加入12.0 mL (174.4 mmol)新蒸餾的吡咯，然后再加入0.03 mL的三氟乙酸作催化劑，室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)停止后，將粗產(chǎn)物用飽和碳酸鈉溶液洗滌一次，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離，得到1.42 g的灰白色固體III，產(chǎn)率為46%ο 核磁氫譜:? NMR (400 MHz，CDC13) δ ppm:7.34 (d, /= 2.27 Hz, 1H)，6.99 (d,/= 8.32 Hz, 1H), 6.76 (m, 2H)，6.19 (dd, /=5.93，3.03 Hz, 3H), 6.05 (m, 2H),
5.62 (s, 1H), 5.45 (s, 1H)，4.12 (dd, /= 14.48, 7.30 Hz, 1H)，2.05 (s, 1H)。
[0027]實(shí)施例3、
取0.71g (2.06 mmol)化合物III加入150 mL的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 mL干燥的二氯甲烷，然后加入0.51 g (2.24 mmol)DDQ，室溫下攪拌反應(yīng)1.5 h。再加入2.9 mL(20.61 mmol)三乙胺，最后緩慢加入3.9 mL (30.86 mmol)三氟化硼乙醚，室溫下攪拌反應(yīng)22 ho反應(yīng)結(jié)束后，將以上粗產(chǎn)物用50 mL蒸餾水水洗三次，然后用二氯甲烷萃取，硅膠柱純化，得到橘紅色固體化合物物IV 0.3 g，產(chǎn)率約為42%。核磁氫譜:? NMR (400 MHz,CDC13) δ ppm: 7.98 (s, 2H), 7.69 (m, 5H), 7.55 (d, /= 2.41 Hz, 1H), 7.17 (d, J=8.67 Hz, 1H), 6.96 (d, /= 4.33 Hz, 2H), 6.57 (d, /= 3.69 Hz, 2H), 5.43 (s, 1H)。
[0028]實(shí)施例4、
取0.10 g(0.26 mmol)化合物IV加入到100 mL的三口燒瓶中氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入0.04 mL(0.31 mmol)干燥的三乙胺和10mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降溫，加入0.026 mL(約0.31 mmol)丙烯酰氯。冰浴下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)停止后，加入少量水淬滅。將以上粗產(chǎn)物經(jīng)過水洗、萃取、干燥、硅膠柱純化后。得到純的0.04克橘紅色化合物，產(chǎn)率約為35%。核磁氫譜:? NMR (400 MHz, CDC13) δ ppm: 7.93 (s, 2H)，7.87 (dd, /=8.50,
2.55 Hz, 1H), 7.77 (dd, /= 17.24，10.54 Hz, 2H)，7.71 (m, 3H)，7.49 (m, 1H)，
6.86 (d, /= 4.28 Hz, 2H)，6.52 (d, /= 3.12 Hz, 2H), 6.33 (dd, /= 17.27，1.11Hz, 1H), 6.06 (d, /= 17.2 Hz, 1H)，5.89 (dd, /= 10.53，1.03 Hz, 1H)。
[0029]實(shí)施例5、熒光實(shí)驗(yàn)
取實(shí)施例1制備的熒光探針化合物，溶解到含有50%乙腈的水溶液中，用HEPES緩沖溶液調(diào)節(jié)pH = 7.4 ;得熒光探針溶液，備用。
[0030]1、取熒光探針溶液，分23組，每組10毫升，其中1組不加氨基酸，22組分別加入含有 Cys, Hey, GSH, Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met,Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val，使得每組溶液中含有探針化合物的濃度為5 μ Μ,氨基酸濃度為300 μΜ，使得氨基酸與探針化合物的摩爾比為60:1 ;采用激發(fā)波長為360nm，熒光光度計(jì)測試其熒光強(qiáng)度，如圖5所示，結(jié)果顯示:本發(fā)明探針溶液本身具有很強(qiáng)的熒光，發(fā)射波長為525 nm, 一旦加入半胱氨酸，其熒光迅速淬滅，加入高半胱氨酸和谷胱甘肽熒光少許淬滅，而其他氨基酸加入后溶液的熒光沒有變化，對半胱氨酸具有很高的選擇性。
[0031]2、取熒光探針溶液，分13組，每組10毫升，分別加入不同濃度的半胱氨酸溶液，調(diào)節(jié)到溶液中含有探針化合物的濃度為5 μ M，半胱氨酸的濃度分別為探針化合物濃度的0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60倍。采用激發(fā)波長為360 nm，熒光光度計(jì)測試其熒光強(qiáng)度，如圖6所示，結(jié)果顯示:溶液在525 nm處熒光迅速淬滅，其熒光強(qiáng)度與濃度成線性關(guān)系。根據(jù)測試計(jì)算，本探針化合物的最低檢測限為3.7 X ΙΟ'8 mol/Lo
[0032]實(shí)施例6、細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn):將HUVEC細(xì)胞在37°C條件下于含有20微摩爾每升的本發(fā)明探針I(yè)的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)30分鐘，探針分子迅速的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并顯示出強(qiáng)熒光，然后用1.2毫摩爾每升的半胱氨酸處理3.5小時(shí)，其強(qiáng)熒光迅速淬滅(如圖8)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種半胱氨酸熒光探針化合物，具有式I所示的結(jié)構(gòu)(如圖1)。2.一種權(quán)利要求1所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，包括如下步驟: 本發(fā)明所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，包括如下步驟: (1)將4-氰基聯(lián)苯酚和無水氯化鎂混合溶于乙腈中，再加入適量的三乙胺和多聚甲醛，反應(yīng)加熱回流五小時(shí)，得到化合物II (如圖2); (2)將上步制得化合物II溶于二氯甲烷中，緩慢加入吡咯和少量三氟乙酸催化，室溫反應(yīng)攪拌一小時(shí)，得到化合物III(如圖3); (3)將上步制得的化合物III溶于二氯甲烷中，加入適量DDQ并在室溫下攪拌1.5小時(shí)，之后再加入三乙胺和三氟化硼-乙醚溶液，并在室溫下攪拌反應(yīng)22小時(shí)，得到化合物IV(如圖4)； (4)將上步制得的中間產(chǎn)物IV溶于二氯甲烷中，加入三乙胺和丙烯酰氯，在冰浴下反應(yīng)4小時(shí)，得到探針分子化合物I。3.如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于步驟(1)所述氰基聯(lián)苯酚、無水氯化鎂、三乙胺和多聚甲醛的摩爾比為1:1.5:4:15。4.如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于步驟(2)所述化合物I1、三氟乙酸和吡咯的摩爾比為1:0.1:20ο5.如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于步驟(3)所述化合物II1、DDQ、三乙胺和三氟化硼-乙醚的摩爾比為1:1.2:10:15。6.如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于步驟(4)所述化合物IV、三乙胺和丙烯酰氯的摩爾比為1:1.2:1.2； 如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于步驟(1)- (4)全程在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，且步驟(1)反應(yīng)回流溫度為81°C。7.如權(quán)利要求2所述的半胱氨酸熒光探針化合物的制備方法，其特征在于，步驟如下: (a)取6.24 g (32mmol)的氰基聯(lián)苯酸和4.56 g (48 mmol)的無水MgCl2于三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，再加入16.3 mL (122 mmol)三乙胺，然后加入了 80 mL無水乙腈，最后加入干燥的多聚甲醛12.32 g (440 mmol)，加熱回流8小時(shí)；反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，然后用少量水進(jìn)行淬滅，再加入大量的6 Μ鹽酸進(jìn)行酸化，二氯甲烷萃取，硅膠柱分離，得到白色固體化合物II 3.51 g，產(chǎn)率約為50% ； (b)取2.00 g (8.96 mmol)產(chǎn)物II加入150 mL的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 mL干燥的二氯甲烷，室溫下攪拌； 待溶解后再緩慢地加入12.0 mL (174.4 mmol)新蒸餾的吡咯，然后再加入0.03 mL的三氟乙酸作催化劑，室溫?cái)嚢?小時(shí)；反應(yīng)停止后，將粗產(chǎn)物用飽和的碳酸鈉溶液洗滌一次，二氯甲烷萃，硅膠柱分離，得到1.42 g的灰白色固體產(chǎn)物III，產(chǎn)率為46%; (c)取0.71g(2.06mmol)產(chǎn)物III加入150 ml的三口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入50 ml干燥的二氯甲烷，然后加入0.51 g (2.24 mmol) DDQ，室溫下攪拌反應(yīng)1.5 h，再加入2.9 mL(20.61 mmol)三乙胺，最后緩慢加入3.9 mL (30.86 mmol)三氟化硼乙醚，室溫下攪拌反應(yīng)22 h;反應(yīng)結(jié)束后，將以上粗產(chǎn)物用50 mL蒸餾水水洗三次，然后加入二氯甲烷萃取，硅膠柱純化，得到橘紅色固體化合物IV 0.3 g，產(chǎn)率約為42% ； (d)取0.10g (0.26 mmol)中間產(chǎn)物IV加入100 mL的三口燒瓶中氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入0.04 mL (0.31 mmol)干燥的三乙胺和10 mL干燥的二氯甲烷，待全部溶解后冰浴降溫，加入0.026 mL (約0.31 mmol)丙烯酰氯，冰浴下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)停止后，加入少量水淬滅。8.將以上粗產(chǎn)物經(jīng)過水洗、萃取、干燥、硅膠柱純化后，得到0.04克橘紅色化合物，產(chǎn)率約為35%。9.權(quán)利要求1所述的半胱氨酸熒光探針化合物的應(yīng)用，可以用于檢測水體中的半胱氨酸含量以及細(xì)胞成像研究。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種半胱氨酸熒光探針化合物及其制備與應(yīng)用，所述半胱氨酸熒光探針化合物具有式I的結(jié)構(gòu)。制備方法是：將4-氰基聯(lián)萘酚與多聚甲醛反應(yīng)，得到的產(chǎn)物II與吡咯反應(yīng)得到中間產(chǎn)物III，之后DDQ氧化脫氫、與三氟化硼-乙醚螯合，丙烯酰氯羥基氫而得。該探針化合物對半胱氨酸具有很好的選擇性和靈敏性，且對細(xì)胞沒有毒性，可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)的檢測和成像。
【IPC分類】C07F5/02, C12Q1/02, C09K11/06, G01N21/64
【公開號】CN105418662
【申請?zhí)枴緾N201510664252
【發(fā)明人】呂正亮, 黃曦明, 范春華
【申請人】濟(jì)南大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年10月14日