一種固液結合制備特利加壓素的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽合成領域，特別涉及一種固相和液相結合制備特利加壓素的方法。
技術背景
[0002]特利加壓素(Terlipressin)最早由Ferring公司開發(fā)，于1977年首先在荷蘭作為止血藥上市，商品名為Glypressin;之后又以商品名Glypressine在法國、德國、英國上市，用于治療消化道靜脈曲張出血;Ferring公司于1999年，在中國取得該品種的上市許可。
[0003]特利加壓素為賴氨酸加壓素衍生物，本身無活性，在體內經氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個甘氨酰殘基后，緩慢“釋放”出有活性的賴氨酸加壓素。其結構如下:Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys]-Pro-Lys-Gly-NH2
[0004]Ferring公司申請的專利SK278755(CZ281589)采用Boc保護氨基酸固相合成工藝制備特利加壓素，此合成工藝中用到HF，對生產設備要求較高，三廢較嚴重，規(guī)模放大較困難。專利CN1865282B采用Fmoc保護氨基酸固相合成工藝制備特利加壓素，避免了 HF的使用，降低了對環(huán)境的污染;其氧化工藝為液相氧化，溶液濃度不能過高，操作復雜，副反應較多，后期純化難度較大，生產成本高。專利CN101693738A同樣采用Fmoc保護氨基酸固相合成了線性特利加壓素肽樹脂，然后采用碘氧化固相成環(huán)工藝形成二硫鍵，然后經裂解，純化、凍干得精肽，簡化了操作過程，便于規(guī)模性放大;但是存在成環(huán)較困難，粗肽純度較低的缺點。專利CN102408471A，為了解決工藝中容易產生特利加壓素土Gly的雜質，特采用Fmoc-Gly-0H和CTC樹脂合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-CTC樹脂，然后經裂解得到單體Fmoc-Gly-Gly-Gly-0H，在固相接肽合成線性特利加壓素肽樹脂;雖然有效的避免了特利加壓素±617的雜質的產生，但是提高了生產成本。專利CN104371008A采用片段合成的方法來制備特利加壓素，其公布的液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH或Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH方法，需要經過偶聯、脫保護、再偶聯、再脫保護等四個步驟，且所選原料H-Gly-OMe或Η-Gly-OtBu價格較高，整個制備過程操作復雜，不適合規(guī)模放大生產。
[0005]本發(fā)明人為了解決特利加壓素±617雜質的生成，降低純化難度；同時為了簡化特利加壓素的生產工藝，提高收率，降低生產成本，對特利加壓素的合成方法進行了研究，從而得到本發(fā)明的技術方案。

【發(fā)明內容】

[0006]為了解決現有技術的不足，本發(fā)明提供了一種特利加壓素的固相和液相相結合的制備方法。本發(fā)明采用常規(guī)的保護氨基酸作為起始原料，降低了合成難度，提高了精肽純度，降低了生產成本，有利于規(guī)?；I(yè)生產。
[0007]為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案:
[0008]—種固液結合制備特利加壓素的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0009](a)以Boc-Gly-OH和雙甘肽為原料，液相合成片段肽A:BoC-Gly-Gly-Gly-0H;
[0010](b)以Fmoc保護氨基酸和氨基樹脂依次偶聯，固相合成片段肽B樹脂:
[0011 ] H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(T;rt)-Cys]-P;ro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂
[0012](c)片段肽A和片段肽B樹脂偶聯，固相合成特利加壓素的肽樹脂:
[0013]Boc-Gly-Gly-Gly-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-GIn(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂
[0014](d)特利加壓素肽樹脂經裂解、純化、轉鹽、凍干得醋酸特利加壓素精肽。
[0015]以上技術方案中，步驟(a)的具體操作步驟為:
[0016]將Boc-Gly-OH和HOSu按照摩爾比1:1?1.2的比例溶解在四氫呋喃中，待完全溶解后，冰水浴下滴加入1.0-1.2倍摩爾量(以Boc-Gly-OH的量計)的DCC四氫呋喃溶液;撤冰水浴，室溫下繼續(xù)攪拌反應3-4h;濾除白色沉淀，四氫呋喃洗滌3次，合并洗液和濾液;旋蒸濃縮濾液和洗液至原體積的1/3，加入石油醚析晶，過濾得白色固體Boc-Gly-OSu，抽干后待用；
[0017]將雙甘肽與堿A按照摩爾比1:1?2的比例溶解在水中，加入5?20%體積的有機溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入0.5?1.0倍摩爾量(以雙甘肽的量計)Boc-Gly-OSu的有機溶劑B溶液;繼續(xù)攪拌反應，TLC監(jiān)測反應終點，待反應結束減壓蒸掉有機溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，析晶得Boc-Gly-Gly-Gly-OH。
[0018]以上步驟中，所述堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙胺、N-乙基二異丙基胺、N，N-二異丙基乙胺等中的一種;有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一種或幾種。
[0019]以上技術方案中，步驟(b)中片段肽B樹脂合成的具體操作步驟為:以Rinkamideresins或Rink amide AM resins為固相載體，經脫保護試劑處理后，以2_5倍的摩爾投料比，加入相應的Fmoc保護氨基酸進行偶聯反應，每一個偶聯反應均是在縮合劑的存在下進行的固相接肽反應，得到H-Cys (Trt)-Tyr (OtBu )-Phe_Gln( Trt) _Asn( Trt )_Cys (Trt)-Pro-Lys(B0C)-Gly-氨基樹脂；然后用2-5倍的摩爾投料比，加入碘的DMF溶液，氧化反應40?120min，然后 DMF 洗滌樹脂六次，得到片段肽 B 樹脂:H-C[CyS-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-ASn(Trt) -Cys ] -Pro-Lys (Boc )-Gly-氨基樹脂。
[0020]以上技術方案，步驟(c)的具體操作步驟為:稱取2-5倍摩爾投料比Boc-Gly-Gly-Gly-0H和縮合劑，放入溶解瓶中，加入DMF溶解完全，加入裝有片段肽B樹脂的合成柱中，室溫下攪拌反應，kaiseH式劑檢測反應終點。
[0021 ] 其中步驟(b)或(c)中所述氨基樹脂為Rink amide resins和Rink amide AMres ins中的一種，樹脂替代度為0.4_1.2mmol/g。
[0022]其中步驟(b)或(c)中的具體操作步驟中所述縮合劑為DIC/H0BT、DIC/H0AT、TBTU/H0BT/DIPEA、HBTU/H0BT/DIPEA、HATU/H0AT/DIPEA 的一種；脫保護試劑為 15 ?25%(體積含量)哌啶/DMF溶液。
[0023]以上技術方案，步驟(d)中裂解所用裂解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液，所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三異丙基硅烷中的一種或幾種。
[0024]本發(fā)明的有益效果為:
[0025]1)、本申請采用雙甘肽作為起始原料，其價格便宜且易獲得，利用雙甘肽在堿性條件下可以和Boc-Gly-Osu發(fā)生偶聯反應，生成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的性質，簡化了其制備過程，降低了合成成本，提高了終產品的純度；
[0026]2)、本發(fā)明中二硫鍵的形成工藝，采用了先制備H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe_Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂，然后固相條件下碘氧化的方法，這樣可以減少Fmoc-Gly-Gly-Gly-基團的空間位阻，有利于二硫鍵的形成，提高粗肽的純度。
[0027]說明書和權利要求書中所使用的縮寫含義如下:
[0028]Fmoc9_荷甲氧幾基
[0029]Rink amide resinsRink酰胺樹脂
[0030]Rink amide AM resins Rink酰胺AM樹脂[0031 ]tBu 叔丁基
[0032]Trt三苯甲基
[0033]Boc叔丁氧羰基
[0034]NMPN-甲基-2-吡咯烷酮
[0035]DCM二氯甲烷
[0036]DMFN，N-二甲基甲酰胺
[0037]DMAP4-二甲氨基吡啶
[0038]DIPEAN，N_ 二異丙基乙胺
[0039]DICN，N-二異丙基碳二亞胺
[0040]HBTU苯并三氮唑4少少’4’-四甲基脲六氟磷酸鹽
[0041 ]HATU 2-(7-偶氮苯并三氮挫)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
[0042]TBTU0-苯并三氮唑州少少’4’-四甲基脲四氟硼酸
[0043]Η0ΒΤ1-輕基苯并三唑
[0044]Η0ΑΤ1-輕基-7-偶氮苯并三氮唑
[0045]TFA三氟乙酸
[0046]TIS三異丙基硅烷
【具體實施方式】
[0047]下面用具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不限定本專利;根據本發(fā)明改變原料的投料比、或是反應溶劑或及縮合劑等，均在本發(fā)明的保護范圍內。
[0048]實施例1:Boc-Gly-Gly-Gly-0H 的制備
[0049]準確稱取Boc_Gly-0H105.lg(0.6mol)和H0Su69.0g(0.6mol)溶于 1.2L四氣咲喃中，待完全溶解后，低溫(2-8°C)下滴加入DCC123.6g(0.6mol)四氫呋喃溶液600ml;撤冰水浴，室溫下繼續(xù)攪拌反應3h;濾除白色沉淀，300ml四氫呋喃洗滌3次，合并洗液和濾液;旋蒸濃縮濾液和洗液至1.0L，加入3.0L石油醚析晶，過濾得白色固體，石油醚洗滌三次，抽干后用1.0L四氫呋喃復溶，待用；
[0050]準確稱取雙甘肽Gly-Gly-0H79.8g(0.6mol)和碳酸鈉 127.2g( 1.2mol)溶于1200mL水中，低溫下(2-8°C)緩慢加入Boc-Gly-OSu的四氫呋喃溶液，攪拌反應，TLC監(jiān)測反應終點，反應完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10 %檸檬酸水溶液調溶液pH值至2?3，1000ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機相