速效胰島素前體蛋白以及速效胰島素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種速效胰島素前體蛋白、其編碼基因、包含該編碼基因的克隆載體 或表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體，以及利用該速效胰島素前體蛋白制備速效胰島素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（InternationalDiabetesFederation，IDF)的最新統(tǒng)計(jì)數(shù) 據(jù)顯示，2014年全球糖尿病患者人數(shù)已經(jīng)高達(dá)3. 87億，按目前的增長速度，預(yù)測到2035年 全球?qū)⒂薪?. 92億人患糖尿病。令人擔(dān)憂的是，中國糖尿病患者更是高達(dá)9628. 8萬人，是 全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家。
[0003] 包括門冬胰島素、賴脯胰島素在內(nèi)的速效胰島素屬于第三代胰島素，可用于成人I 型糖尿病和II型糖尿病的治療。門冬胰島素還可用于兒童、青少年和孕婦及哺乳期婦女糖 尿病的治療。門冬胰島素的問世，為拯救糖尿病患者的生命，提高患者的生活質(zhì)量，帶來了 新的曙光。
[0004] 門冬胰島素是一種人胰島素類似物，由A、B兩條鏈組成，與人胰島素不同的是其B 鏈第28位脯氨酸替換為天門冬氨酸，利用電荷的排斥作用阻止了胰島素單體的自我聚集， 從而迅速吸收，因此起效比人胰島素更快。因此，門冬胰島素彌補(bǔ)了人胰島素的不足，使外 源性胰島素能更好地滿足餐時胰島素需求，包括餐前注射吸收迅速、穩(wěn)定，達(dá)峰時間短，從 而更有效地控制餐后高血糖。
[0005]目前用重組DNA技術(shù)表達(dá)胰島素及胰島素類似物，主要有三種方法。第一種方法 是利用大腸桿菌表達(dá)胞內(nèi)融合蛋白，通過破壁收獲包涵體，再經(jīng)變復(fù)性、酶解方式等處理獲 得胰島素或胰島素類似物分子。大腸桿菌有生長迅速，培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢，但是其缺點(diǎn)也非 常明顯：因?yàn)榇竽c桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)大多數(shù)以包涵體形式存在，必須經(jīng)過破壁、包涵體收集 與變復(fù)性處理才能得到活性分子，但這些處理方法存在能耗大，工藝繁瑣，收率不高等諸多 缺點(diǎn)。
[0006] 例如，美國專利US20140221606A1公布了一種腸桿菌制備速效胰島素的方法，該 方案在A鏈和B鏈之間添加了一段35個氨基酸殘基的C肽，使速效胰島素前體分子的表達(dá) 能力提高至3~5g/L。但是該法通過大腸桿菌表達(dá)的速效胰島素前體分子需經(jīng)過破壁、包 涵體的收集與洗滌、包涵體溶解、稀釋復(fù)性、純化、蛋白酶解等復(fù)雜過程才能獲得完整的速 效胰島素分子，再經(jīng)過一系列層析步驟獲得純品，其制備工藝十分復(fù)雜，產(chǎn)品收率不高。
[0007] 第二種方法是利用釀酒酵母表達(dá)胰島素或胰島素類似物前體分子，使產(chǎn)物分泌到 胞外培養(yǎng)基中，然后經(jīng)捕獲、酶解和轉(zhuǎn)肽等方法制備胰島素或胰島素類似物分子。雖然釀酒 酵母能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到胞外，但也存在一些缺點(diǎn)：如釀酒酵母容易使表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生高度 糖基化，增加了人體發(fā)生免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須在藥物純化過程中增加步驟控制雜質(zhì) 含量。再者，釀酒酵母還存在生長緩慢，發(fā)酵密度不高，啟動子能力較弱等問題，這些缺點(diǎn)導(dǎo) 致產(chǎn)物表達(dá)量低。
[0008] 例如，美國專利US5, 618, 913公布了諾和諾德公司制備門冬胰島素的方法。該方 法以釀酒酵母為表達(dá)宿主，利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)得到門冬胰島素前體，再通過轉(zhuǎn)肽等一 系列復(fù)雜工藝制備門冬胰島素。該方法技術(shù)壁皇高，特別在宿主菌改造、質(zhì)粒構(gòu)建等方面技 術(shù)難度大、工藝復(fù)雜。由于釀酒酵母自身表達(dá)能力較弱，因此產(chǎn)物表達(dá)量不高，其工程菌搖 床培養(yǎng)最高為21. 5mg/L，一定程度上增加了藥品生產(chǎn)成本。
[0009]第三種是利用畢赤酵母表達(dá)胰島素或胰島素類似物前體分子，表達(dá)產(chǎn)物同樣分泌 到胞外培養(yǎng)基中，經(jīng)捕獲、酶解和轉(zhuǎn)肽等方法制備胰島素或胰島素類似物分子。畢赤酵母是 一種非常優(yōu)秀的表達(dá)系統(tǒng)，它可以將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，還有發(fā)酵密度高，產(chǎn)量高等優(yōu) 勢。
[0010] 但是，目前使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)胰島素的方案中仍然面臨著表達(dá)量不高、 產(chǎn)率偏低的挑戰(zhàn)，原因涉及編碼序列、純化方法等多方面。因此，仍有必要提供一種能夠以 更高效率和得率生產(chǎn)胰島素的系統(tǒng)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明一方面提供一種門冬胰島素前體，其氨基酸序列為Zi(XY) nZ2Z3Z4-B(1-29)-(^(^3^(1-21),其中ZpXJA、別為Asp或Glu;Y為Ala或Gly;n為 1 ~ 10 之間的整數(shù)；23為Pro、Glu或Asp;Z4、(：3分別為Lys或Arg ;Cρ〇；分別為Glu、Asp、Ala 或Gly;B(1-29)為門冬胰島素B鏈1-29位氨基酸；并且A(1-21)為門冬胰島素A鏈1-21 位氨基酸。
[0012] 在一個實(shí)施方式中，其中21是6111。在一個實(shí)施方式中，其中X是Glu。在一個實(shí) 施方式中，其中Y是Ala。在一個實(shí)施方式中，其中22是6111。在一個實(shí)施方式中，其中23是 Pro。在一個實(shí)施方式中，其中(；是6111或Asp。在一個實(shí)施方式中，其中(：2是Gly或Ala。 在一個實(shí)施方式中，η為3~10之間的整數(shù)，或η為5~10之間的整數(shù)，或η為7~10之 間的整數(shù)。
[0013] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的門冬胰島素前體的氨基酸序列如SEQIDΝ0. 2所示。 本發(fā)明另一方面提供一種編碼本發(fā)明所述的門冬胰島素前體的核苷酸序列。在本發(fā)明的一 個實(shí)施方式中，該核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，其編碼SEQIDN0. 2所示的氨基酸序 列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該核苷酸序列是因密碼子簡并性或宿主偏好性而與SEQ IDNO. 1所示序列具有一個或幾個核苷酸差異的核苷酸序列。
[0014] 本發(fā)明的另一個方面提供一種含有上述核苷酸序列的克隆載體。在一些實(shí)施方式 中，所述克隆載體為重組質(zhì)粒PPIC9K，重組質(zhì)粒pPICZαA或重組質(zhì)粒pPinkaHC。
[0015] 在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，將編碼所述的門冬胰島素前體基因克隆到質(zhì)粒PPIC9K 中。該重組質(zhì)粒含有一個Α0Χ1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母α-交配因子 信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉(zhuǎn)錄終止子序列，其后 連有一個篩選標(biāo)記HIS4基因序列，其后連有一個篩選標(biāo)記卡那霉素抗性基因序列，其后連 有一個Α0Χ1基因的3'末端序列。
[0016] 在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，將編碼所述門冬胰島素前體基因克隆到質(zhì)粒 pPICZaΑ中。該重組質(zhì)粒含有一個Α0Χ1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母 α-交配因子信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉(zhuǎn)錄終止 子序列，其后連有一個篩選標(biāo)記Zeocin抗性基因序列。
[0017]在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，將編碼所述門冬胰島素前體基因克隆到質(zhì)粒pPinka-HC中。該重組質(zhì)粒含有一個A0X1基因啟動子序列，其后連有一個來自釀酒酵母 a-交配因子信號肽序列，其后連有一個門冬胰島素前體基因序列，其后連有一個轉(zhuǎn)錄終止 子序列，其后連有一個篩選標(biāo)記ADE2基因序列。
[0018]本發(fā)明的再一方面提供一種包含本發(fā)明所述克隆載體的表達(dá)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方 式中，一個所述表達(dá)系統(tǒng)含有1-12個拷貝的克隆載體。在一些實(shí)施方式中，所述表達(dá)系統(tǒng) 為畢赤酵母細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述畢赤酵母細(xì)胞為畢赤酵母GS115、畢赤酵母X-33 或畢赤酵母PichiaPink。
[0019]本發(fā)明的再一方面提供一種制備門冬胰島素的方法，該方法包括：(a)培養(yǎng)本發(fā) 明所述的表達(dá)系統(tǒng)；(b)分離、富集得到門冬胰島素前體；（c)用胰蛋白酶或賴氨酰內(nèi)切酶 進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，獲得門冬胰島素粗品；以及（d)純化獲得門冬胰島素。在一些實(shí)施方式中，在步 驟（a)之前，對本發(fā)明所述的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行篩選，以選擇出表達(dá)水平最高的表達(dá)系統(tǒng)，再培 養(yǎng)所篩選出的表達(dá)系統(tǒng)。
[0020] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種制備門冬胰島素的方法，該方法包括：(a)培 養(yǎng)含有本發(fā)明編碼序列的畢赤酵母細(xì)胞，收集含門冬胰島素前體的發(fā)酵上清液；(b)大孔 樹脂富集門冬胰島素前體，冷凍干燥獲得干粉；（c)用胰蛋白酶或賴氨酰內(nèi)切酶進(jìn)行轉(zhuǎn)肽， 獲得門冬胰島素粗品；（d)用DEAE離子交換樹脂和C8介質(zhì)純化獲得門冬胰島素純品。
[0021] 與原研藥和其他門冬胰島素表達(dá)技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：
[0022] (1)產(chǎn)物表達(dá)量高的優(yōu)勢：本發(fā)明首次設(shè)計(jì)了獨(dú)特的前導(dǎo)肽引導(dǎo)門冬胰島素的表 達(dá)，該前導(dǎo)肽是一段親水性的短肽，可以使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上更加穩(wěn)定，免受宿主菌蛋白酶 的破壞，大大提高門冬胰島素前體的表達(dá)量。本發(fā)明還使用了啟動能力強(qiáng)的醇氧化酶啟動 子A0X1，分泌能力強(qiáng)的α-交配因子信號肽以及可高密度發(fā)酵培養(yǎng)的畢赤酵母表達(dá)宿主， 進(jìn)一步增加了門冬胰島素前體的表達(dá)和分泌能力。使用本發(fā)明的表達(dá)方法，搖床培養(yǎng)門冬 胰島素前體最高表達(dá)可達(dá)150mg/L，20L發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)時最高表達(dá)量可達(dá)5g/L。
[0023] (2)發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物純度高，雜質(zhì)少的優(yōu)勢：傳統(tǒng)門冬胰島素的表達(dá)方法，未添加前 導(dǎo)肽，存在以下兩方面的缺陷：（1)使門冬胰島素前體B鏈的第一個氨基酸（Phe)暴露于外 部環(huán)境中，容易被畢赤酵母的氨肽酶破壞，增加了雜質(zhì)的含量。（2)當(dāng)表達(dá)量過高時，由于畢 赤酵母的KEX2蛋白酶相對不足，從而使部分門冬胰島素前體的N末端殘留了 1-9個的α信 號肽的氨基酸殘基，也增加了雜質(zhì)的含量。這些雜質(zhì)與門冬胰島素的性質(zhì)十分相似，難以去 除。本發(fā)明發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物純度高，且門冬胰島素前體的Ν末端存在前導(dǎo)肽，故不會產(chǎn)生Phe 缺失的雜質(zhì)。另外，即使N末端殘留了部分α信號肽的氨基酸殘基，也會在制備過程中一 并切除。
[0024] (3)產(chǎn)物分泌到胞外培養(yǎng)基中，提取方法簡單的優(yōu)勢：本發(fā)明產(chǎn)物以水溶性存在， 且分泌到胞外培養(yǎng)基中，通過過濾或離心方法很容易得到含門冬胰島素前體的上清液，然 后直接用于后續(xù)純化和制備。
[0025] (4)制備方法簡單，收率高的優(yōu)勢：本發(fā)明只需要使用胰蛋白酶或賴氨酰內(nèi)切酶 將門冬胰島素前體經(jīng)過一步轉(zhuǎn)肽反應(yīng)即可得到完整的門冬胰島素分子，