一種用于免疫治療的eb病毒lmp2a串聯(lián)表位肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯(lián)表 位肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV)屬于皰疹病毒γ亞科嗜淋巴細(xì)胞病毒成員， 是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)與腫瘤發(fā)生有關(guān)的人類病毒。ΕΒ病毒感染的靶細(xì)胞主要為Β淋巴細(xì) 胞。最近的研究證實(shí)，ΕΒ病毒還可感染人體Τ細(xì)胞、ΝΚ細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞。ΕΒ病毒感染與 多種疾病有關(guān)，如與非洲兒童Burkit淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、成人Τ/ΝΚ細(xì)胞淋巴 瘤、各種免疫抑制劑治療患者和器官移植患者淋巴細(xì)胞增生紊亂引起的淋巴瘤及EBV相關(guān) 的噬血細(xì)胞增多癥等密切相關(guān)。EB病毒感染靶細(xì)胞后表達(dá)多種蛋白，包括6種核抗原EBN A1、2、3A、3B、3C、和LP，3種潛伏期膜蛋白LMP1、2A、2B)和2種基因EBER-1、2，其中LMP2 (LMP2A、2B)在噬血細(xì)胞綜合癥、淋巴瘤和淋巴細(xì)胞增殖病細(xì)胞中均有表達(dá)。EB病毒的這些 蛋白抗原可以誘發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
[0003] 自1964年在鼻咽癌（nasopharyngealcarcinoma，NPC)組織中首先發(fā)現(xiàn)存在有EB 病毒DNA以來，大量的血清流行病學(xué)研究已證明EB病毒與鼻咽癌有關(guān)。鼻咽癌是上皮來源 的惡性腫瘤，高發(fā)于東南亞及我國(guó)華南地區(qū)。臨床上鼻咽癌通常不宜手術(shù)治療，放療、化療 后也不能完全有效清除腫瘤細(xì)胞，部分患者易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且治療產(chǎn)生的副作用又影響 了自身的免疫系統(tǒng)。因此目前，在倡導(dǎo)鼻咽癌綜合治療的同時(shí)更加注重免疫治療。
[0004] T細(xì)胞只能識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞（APC)遞呈的抗原肽-MHC分子復(fù)合物。樹突狀細(xì) 胞（DC)是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的APC，能激發(fā)初始型和記憶型T細(xì)胞，產(chǎn)生有效的CTL應(yīng)答。 其以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已在許多腫瘤的治療中取得了良好的效果，可對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 有效的靶向性殺傷，而不傷害正常細(xì)胞，是當(dāng)前抗腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)之一。但是，目 前的殺瘤效率都還較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯(lián)表位 肽及其應(yīng)用，將所述EB病毒LMP2A(latentmembraneprotein2A，潛伏膜蛋白2A)串聯(lián) 表位肽負(fù)載人外周血來源的DCs，DCs可被有效地激活，誘導(dǎo)成熟并能夠?qū)⑵溥f呈到DCs (dendriticcells，樹突狀細(xì)胞)細(xì)胞表面，與CTL細(xì)胞共培養(yǎng)后可激活特異性的抗病毒CTL (cytotoxicTlymphocytes，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)，并可分泌更多的細(xì)胞因子，促進(jìn)淋巴細(xì) 胞的增殖，具有更顯著的腫瘤殺傷功能，更高的腫瘤細(xì)胞殺傷效率。
[0006] 對(duì)此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯(lián)表位肽，所述用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯(lián)表位肽包括SEQIDNO: 1的氨基酸序列。
[0007] 采用此技術(shù)方案，將LMP2A356364和LMP2A 426434進(jìn)行串聯(lián)，得到LMP2A串聯(lián)表位肽 LMP2A356 364/426 434?LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列為： LMP2A356364：FLYALALLL； LMP2A426434：CLGGLLTMV； 兩者串聯(lián)后得到的串聯(lián)表位妝LMP2A356 364/426 434的序列為： 串聯(lián)表位肽LMP2A:FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0008] 用體外構(gòu)建質(zhì)粒，包裝病毒轉(zhuǎn)染DCs的方法雖然可使目的蛋白在DCs內(nèi)表達(dá)，但 病毒的安全性在臨床應(yīng)用中仍受到一定限制，且不易被患者所接受。另外病毒對(duì)DCs的感 染效率和表達(dá)效率都與病毒包裝的滴度相關(guān)，操作重復(fù)性較差。而采用抗原表位肽對(duì)DCs 直接負(fù)載，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性高，而且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)現(xiàn)LMP2A的串聯(lián)肽與單個(gè)表位肽相 比，能更有效地誘導(dǎo)DCs成熟，促進(jìn)特異性CTL的增殖，能夠更加有效地靶向性殺傷鼻咽癌 細(xì)胞系。
[0009] 所述LMP2A串聯(lián)表位肽356 364/426 434負(fù)載DCs后，能更加有效地促進(jìn)DCs成熟和表 位肽遞呈能力，可以分泌更多的細(xì)胞因子。負(fù)載了該串聯(lián)表位肽的DCs與CTL共培養(yǎng)后，可 誘導(dǎo)出EB病毒特異性的CTL細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明，其在體外和體內(nèi)均可有效地靶向性殺傷鼻咽 癌細(xì)胞系CNE1。
[0010] 通過體外細(xì)胞培養(yǎng)方法激活和大量增殖患者自身的DCs，有效負(fù)載病毒的抗原多 肽，并與大量增殖的CTL細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，再回輸患者體內(nèi)，直接提高了患者的抗病毒能力， 打破機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)。
[0011] 本發(fā)明還公開了所述用于免疫治療的EB病毒LMP2A串聯(lián)表位肽的應(yīng)用，其用于EB 病毒相關(guān)的疾病的免疫細(xì)胞臨床治療中。進(jìn)一步的，用于鼻咽癌的免疫細(xì)胞臨床治療中。
[0012] 鼻咽癌患者體內(nèi)存在不同程度的免疫功能低下，其中DCs的數(shù)量和功能均有缺 陷，患者的抗原提呈細(xì)胞（AntigenPresentingCell,APC)往往不能正確地處理和提呈抗 原信號(hào)，直接影響了有效的CTL抗病毒反應(yīng)。因此采用EB病毒LMP2A表位肽體外致敏DCs 再回輸給患者，可大大提高DCs對(duì)病毒抗原的提呈能力，激發(fā)特異性CTL的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明的技術(shù)方案采用將EB病毒潛伏膜蛋白不同抗原多肽串聯(lián)在一起，體外合成串 聯(lián)表位肽，負(fù)載人外周血來源的DCs，發(fā)現(xiàn)其可以更加有效地促進(jìn)DCs增殖和成熟，使其可 以分泌更多的細(xì)胞因子，負(fù)載了該串聯(lián)表位肽的DCs與CTL共培養(yǎng)后，可激活特異性的抗病 毒CTL，誘導(dǎo)出EB病毒特異性的CTL細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，在體外和體內(nèi)均可有效地 靶向性殺傷鼻咽癌細(xì)胞系CNE1，且效果比單獨(dú)應(yīng)用LMP2A356 364或LMP2A426 434或兩種表位肽 混合物更好。
[0014] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的技術(shù)方案能達(dá)到更高的誘導(dǎo)效率 和體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的有效性，其誘導(dǎo)效率比現(xiàn)有技術(shù)高10-20%。由此可見，本發(fā)明技術(shù)方案 的LMP2A串聯(lián)表位肽在治療鼻咽癌及EB病毒相關(guān)的其它疾病的免疫細(xì)胞臨床治療方面具 有巨大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明一種實(shí)施例串聯(lián)表位肽負(fù)載DCs的負(fù)載效率熒光檢測(cè)結(jié)果圖，從左 到右依次為放大100倍，200倍和400倍的圖。
[0016]圖2是本發(fā)明一種實(shí)施例采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表位肽負(fù)載后DCs表型的檢測(cè)分 析圖。圖中，LMP2A356-364/426-434DC為L(zhǎng)MP2A串聯(lián)表位肽負(fù)載DCs，LMP2Amix為混合 LMP2A356 364和LMP2A426 434表位肽負(fù)載DCs，LMP2A356-364DC為L(zhǎng)MP2A356 364表位肽負(fù)載DCs， LMP2A426-434DC為L(zhǎng)MP2A426 434表位肽負(fù)載DCs，下同。
[0017] 圖3是本發(fā)明一種實(shí)施例負(fù)載了表位肽的DCs與T細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)六天 后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBL的增殖曲線圖。
[0018] 圖4是本發(fā)明一種實(shí)施例負(fù)載了串聯(lián)表位肽的DCs活化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢 測(cè)圖，其中A為IL-2分泌檢測(cè)；B為IFN- γ分泌檢測(cè)；C為TNF- α分泌檢測(cè)。
[0019] 圖5是本發(fā)明一種實(shí)施例負(fù)載了串聯(lián)表位肽的DC-CTL體外的殺瘤效率檢測(cè)分析 圖。
[0020] 圖6是本發(fā)明一種實(shí)施例負(fù)載了串聯(lián)表位肽的DC-CTL治療腫瘤模型動(dòng)物的腫瘤 體積變化分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0022] 1、體外合成ΕΒ病毒串聯(lián)表位肽 本發(fā)明中采用串聯(lián)兩個(gè)HLA*02:01型LMP2A表位肽，LMP2A356 364和LMP2A426 434的序列 為： LMP2A356364：flyalalll； LMP2A426434：clgglltmv； 將兩者串聯(lián)得到串聯(lián)表位妝LMP2A356 364/426 434，得到的LMP2A串聯(lián)表位妝的序列為：LMP2A串聯(lián)表位肽：FLYALALLLCLGGLLTMV。
[0023] 將LMP2A串聯(lián)表位肽負(fù)載DC細(xì)胞。
[0024] 按照現(xiàn)有技術(shù)的方法合成上述三種表位肽，本例的串聯(lián)表位肽按照現(xiàn)有技術(shù)的常 規(guī)方法合成。經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜分析鑒定證明合成的表位肽的序列和分子量均正確， 且純度達(dá)到95%以上，符合實(shí)驗(yàn)要求。
[0025] 根據(jù)表位肽的溶解性，將其溶解在水或二甲基亞砜（DMS0)中，表位肽的儲(chǔ)存液濃 度為10mg/ml，用0. 22μm的針筒濾器過濾除菌，分裝后于-20°C保存。采用現(xiàn)有技術(shù)的方 法，進(jìn)行表位肽負(fù)載DCs;表位肽負(fù)載DCs時(shí)表位肽的終濃度為40μg/ml。
[0026] 2、DCs和CTL的分離培養(yǎng) (1)無菌條件下取正常人外周靜脈血60ml，離心后取下層細(xì)胞層，加入PBS(Phosphate BufferedSaline，磷酸鹽緩沖液）以1:1的比例進(jìn)行稀釋后，緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液 上，1000g室溫水平離心25min，取中間白膜層細(xì)胞，用PBS洗兩遍。
[0027] (2)DCs的體外培養(yǎng)和表位肽負(fù)載 加入RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為2X106/ml，在10cm培養(yǎng)皿中加入5ml細(xì)胞懸 液，并放置于37°C，5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2h。然后將其中的懸浮細(xì)胞作為 T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞加入DCs培養(yǎng)基中，所述DCs培養(yǎng)基為含有100ng/mlGM-CSF和 50ng/mlIL-4的RPMI1640培養(yǎng)基。在37°C，5%體積濃度的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每?jī)?天半量換液。第六天，在不同培養(yǎng)皿中分別加入LMP2A串聯(lián)表位肽、LMP2A356 364和LMP2A426 434 表位肽的混合物(兩者濃度比例為1:1 )、表位肽LMP2A356 364、表位肽LMP2A426 434，終濃度均為 40μg/ml。第七天，分別加入50ng/mlTNF-α，培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)DCs的表型。
[0028] (3)T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)和DC-CTL的體外誘導(dǎo) 將步驟（2)中的懸浮細(xì)胞作為T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞濃度調(diào)整為107/ml，與步驟（2)中 負(fù)載了不同表位肽的DCs分別進(jìn)行混合培養(yǎng)，DCs與CTL的比例為1:10。