一種基因工程重組蛋白、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白、其制備方 法及在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)食品行業(yè)面臨著嚴(yán)峻的食品安全問(wèn)題，廋肉精案件即為其中的一個(gè)典型。 如何更有效、更安全地促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率，是亟待我們解決的重要科學(xué)問(wèn)題。 動(dòng)物生理生化已經(jīng)闡明，垂體生長(zhǎng)激素(GH)的分泌受下丘腦生長(zhǎng)激素釋放因子(GHRH和生 長(zhǎng)抑素(SMS)的雙向調(diào)控，前者促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放，后者抑制生長(zhǎng)激素釋放。已有實(shí)驗(yàn)證明， 將生長(zhǎng)抑素與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶連或制成基因疫苗，主動(dòng)免疫動(dòng)物可促進(jìn)其生長(zhǎng)。
[0003]生長(zhǎng)抑素是由14個(gè)氨基酸殘基組成的小肽，免疫原性極弱，將其與具有較強(qiáng)免疫 佐劑活性的天然來(lái)源的蛋白或人工合成的表位構(gòu)建融合蛋白，是增強(qiáng)其免疫原性的一條有 效途徑。大腸桿菌來(lái)源的不耐熱腸毒素(LT)由具有神經(jīng)節(jié)苷脂(GM-1)親和力的B亞基和毒 性A亞基組成，通過(guò)對(duì)A亞基的點(diǎn)突變獲得的重組LTK63和LTR72，毒性減弱數(shù)百倍，具有較強(qiáng) 的黏膜佐劑功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白，其包含生長(zhǎng) 抑素結(jié)構(gòu)域及其片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)及其片段，所述生長(zhǎng)抑素結(jié)構(gòu) 域及其片段和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基及其片段任選地使用接頭進(jìn)行連接。
[0005]本發(fā)明提供一種編碼所述的生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白的氨基酸序列及其對(duì)應(yīng)基因 的核苷酸序列。
[0006]本發(fā)明提供一種包含上述基因序列的重組表達(dá)載體及其對(duì)應(yīng)的重組大腸桿菌基 因工程菌。
[0007]本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)中的用途。
[0008]本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白用于制備促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的藥物組合物或 疫苗組合物的用途，所述藥物組合物或疫苗組合物用于免疫動(dòng)物，使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生中和生 長(zhǎng)抑素的抗體。
[0009]本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)抑素重組嵌合蛋白的制備方法，所述步驟包括構(gòu)建含有生長(zhǎng) 抑素結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基基因的pET28a重組表達(dá)載體，及將所述表達(dá)載 體轉(zhuǎn)入E.co1iBL21 (DE3)菌中進(jìn)行表達(dá)及后續(xù)的提取、分離、溶解、復(fù)性與純化。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是重組蛋白LTB-SMS_01與對(duì)照（Control)生長(zhǎng)抑素（SMS)家兔免疫試驗(yàn)抗體滴 度圖，其中LTB-SMS_01:大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位-生長(zhǎng)抑素融合蛋白。
[0011]圖2是重組蛋白LTB-SMS_01家兔促生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果圖。
[0012] 圖3是重組蛋白LTB-SMS_01雞促生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1 LTB基因的克隆 ①取凍存的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌E.coliK88甘油菌接種至LB培養(yǎng)基，37°C振搖培養(yǎng)過(guò) 夜。次日，按試劑盒說(shuō)明書，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒從E.co1iK88培養(yǎng)液中提取并純化 基因組DNA，用超純水適當(dāng)稀釋，用微量比色皿于260nm與280nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，據(jù)此計(jì) 算DNA含量與純度(OD26〇/OD28q= 1.7_1.9)〇
[0014] ②按常規(guī)方法，將提取的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌基因組DNA(以下簡(jiǎn)稱ETEC基因組 DNA)進(jìn)行瓊脂糖(0.8%)凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像儀進(jìn)行觀察。
[0015] ③PCR:根據(jù)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)的基因序列設(shè) 計(jì)克隆該基因的PCR引物SEQIDN0: 3與SEQIDN0: 4。
[0016] 在0.2mLPCR管中加入ETEC基因組DNA、引物SEQIDNO: 3與SEQIDNO: 4、Pfu PCRMasterMix和雙蒸水，按如下條件：94°C3min-(94°C30s- 55°C30s- 72°C 60s)(30循環(huán))-72°Clmin，以常規(guī)PCR方法克隆E.coliLTB基因。PCR反應(yīng)結(jié)束后，1.5%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(大小在300-350bp之間）并用DNA膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。
[0017] 實(shí)施例2 pET28a/LTB重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ①質(zhì)粒pET28a的制備:取凍存的pET28a/DH5a甘油菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按試劑盒說(shuō)明書，以質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取并純化質(zhì) 粒pET28a，并按常規(guī)方法，用紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒pET28a的濃度與純度，同時(shí)用瓊脂糖 凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
[0018]②質(zhì)粒pET28a的酶切：取一個(gè)干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入滅菌的雙蒸水、lOXBufferTango?緩沖液、pET28a(+)、核酸內(nèi)切酶Ncol與EcoRI，總體積30仙，于37°C反 應(yīng)3h。按試劑盒說(shuō)明書，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化pET28a酶切產(chǎn)物。
[0019] ③ETEC基因組DNAPCR產(chǎn)物（以下簡(jiǎn)稱LTBPCR產(chǎn)物）的酶切：取一個(gè)干凈滅菌的 1.5mLEp管，依次加入LTBPCR產(chǎn)物、滅菌的雙蒸水、lOXBufferTangoTM緩沖液、核酸內(nèi) 切酶Ncol與EcoRI，總體積30仙，于37°C反應(yīng)3h。按試劑盒說(shuō)明書，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純 化LTBPCR酶切產(chǎn)物。
[0020] ④載體和目的基因的連接：取一個(gè)干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入酶切后的 pET28a、LTBPCR產(chǎn)物、雙蒸水、連接緩沖液、T4DNA連接酶，總體積20UL，于20°C反應(yīng)lh。置 于冰上，用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0021 ] 實(shí)施例3 pET28a_LTB/DH5a基因工程重組菌的構(gòu)建 ①E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備：按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，以CaCl2法制備E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0022]②轉(zhuǎn)化與篩選：將酶切后的pET28a_LTBPCR產(chǎn)物連接液用熱激法轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化完成后，加入400yLLB培養(yǎng)液，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取100yL培 養(yǎng)液均勻涂布于LB/Kan瓊脂篩選平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
[0023]③重組菌的鑒定--菌落PCR法鑒定陽(yáng)性克?。河酶蓛魺o(wú)菌的牙簽挑取單菌落 至10yL的雙蒸水中，100°C水浴保溫5min，以裂解菌體；18°C，15，000rpm，離心5min;取5yL 上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0024]取1個(gè)干凈無(wú)菌的0.2mL的薄壁PCR管置于冰上，依次加入DNA模板、引物L(fēng)TB-F和LTB_R、2XPfuPCRMasterMix、滅菌的雙蒸水，總體積20μΙ^4°〇，4,00〇Γρηι短暫離心 lmin，使溶液集中在管底。將PCR管置于PCR儀中，按如下條件:94°C3min-(94°C30s- 55°C30s- 72°C2min)(30循環(huán)）-72°ClOmin，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后利用1.5%瓊 脂糖凝膠電泳，檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物，篩選出陽(yáng)性克隆菌。經(jīng)菌落PCR鑒定后的重組子，送往生 工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0025] 實(shí)施例4 生長(zhǎng)抑素基因（SMS_01)的PCR克隆 ①設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)EcoRI和Xhol的生長(zhǎng)抑素基因引物SEQIDNO: 5與SEQIDNO: 6。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成該基因引物，將合成的SMS_01的上游引物和 下游引物加入PCR退火緩沖液中，95°C變性2分鐘，隨后緩慢退火至室溫。退火產(chǎn)物置于4°C 備用，利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)退火產(chǎn)物。
[0026] 實(shí)施例5 重組質(zhì)粒pET28a-LTB-SMS_01的構(gòu)建 ①重組質(zhì)粒pET28a-LTB的制備：取凍存的pET28a-LTB/E·coliDH5α甘油菌接種于含 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按試劑盒說(shuō)明書，以質(zhì)粒DNA小量提 取試劑盒提取并純化重組質(zhì)粒pET28a-LTB，并按常規(guī)方法，用紫外分光光度法測(cè)定重組質(zhì) 粒的濃度與純度，同時(shí)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
[0027]②重組質(zhì)粒pET28a_LTB的酶切:取一個(gè)干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入滅菌的 雙蒸水、lOXFastDigest?緩沖液、重組質(zhì)粒pET28a-LTB、核酸內(nèi)切酶EcoRI與Xhol，總體 積30HL，于37°C反應(yīng)3h。按試劑盒說(shuō)明書，用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化重組質(zhì)粒pET28a-LTB的酶切產(chǎn)物。
[0028]③載體和目的基因的連接:取一個(gè)干凈滅菌的1.5mLEp管，依次加入酶切后的重 組質(zhì)粒pET28a-LTB、酶切后的生長(zhǎng)抑素基因SMS_01的PCR產(chǎn)物、雙蒸水、連接緩沖液、T4DNA 連接酶，總體積2〇tiL，于20°C反應(yīng)lh。置于冰上，用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0029] 實(shí)施例6 pET28a-LTB-SMS_01 /E.co1iDH5a基因工程重組菌的構(gòu)建 ①E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備：按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，以CaCl2法制備E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。
[0030]②轉(zhuǎn)化與篩選:將酶切后的載體pET28a-LTB和酶切后的生長(zhǎng)抑素基因SMS_01的 PCR產(chǎn)物連接液用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化完成后，加入400yLL