一種透明質(zhì)酸的酯化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸的酯化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸[Acrylatedhyaluronicacid(HA)]是一種線性陰離子聚合物，其基本 結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的大型多糖類。HA廣泛存在 于脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織、粘液組織、眼球之晶狀體及某些細(xì)菌的夾膜中。HA在人類皮膚的 真皮層中扮演了基質(zhì)的重要角色，無(wú)論是組織結(jié)構(gòu)上整體的保養(yǎng)或是細(xì)胞之間的運(yùn)送都具 有很重要的功能。HA的透明質(zhì)分子能攜帶500倍以上的水分，為目前所公認(rèn)的最佳保濕成 分，廣泛應(yīng)用在保養(yǎng)品跟化妝品領(lǐng)域中。
[0003]由于天然HA穩(wěn)定性差，易降解，缺乏生物機(jī)械性能，限制了其作其作為生物材料 的應(yīng)用。因此，對(duì)HA分子進(jìn)行化學(xué)改性，在保持原來(lái)HA特性的同時(shí)引入新的特性，從而改 善其穩(wěn)定性和機(jī)械性能，對(duì)拓寬其適用領(lǐng)域具有很強(qiáng)的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。HA多糖鏈中 的羥基、羧基和乙酰氨基是能被衍生的活性基團(tuán)，其中基于羥基和羧基通過(guò)酯化、交聯(lián)、接 枝等改性產(chǎn)生的衍生物最為常見(jiàn)。HA的酯化一般在羧基上進(jìn)行，旨在改進(jìn)HA的一些理化特 性，如引入一些疏水基團(tuán)，可降低HA的聚陰離子特性，同時(shí)賦予HA以兩親分子特性。常見(jiàn) 的HA酯化衍生物多將藥物共價(jià)連接到HA主鏈上，如類固醇類藥物，不僅達(dá)到藥物緩釋的目 的，而且有助于克服藥物溶解度的限制。但這種改性在應(yīng)用時(shí)具有專一性或藥物目標(biāo)性，不 具備普遍應(yīng)用的值。利用長(zhǎng)鏈脂肪酸或脂肪酸甘油酯，如單硬脂酸甘油酯修飾HA的羧基， 形成兩親性HA衍生物，可以使HA發(fā)生分子聚集，不經(jīng)交聯(lián)即可自組裝形成納米膠束，或自 組裝在藥物載體表面，獲得具腫瘤細(xì)胞靶向的藥物載體。此外，單硬脂酸甘油酯具有良好的 皮膚促滲作用，HA單硬脂酸甘油酯復(fù)合物結(jié)合了二者優(yōu)勢(shì)，可作為具有靶向功能的經(jīng)皮輸 送載體材料。國(guó)際上已經(jīng)有HA單硬脂酸甘油酯復(fù)合物制備的報(bào)道，利用催化交聯(lián)法在水溶 劑中24 - 48h，實(shí)現(xiàn)酯化連接，復(fù)到疏水取代度5 - 23%的產(chǎn)品。但由于EDC在水溶劑中容 易產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，水溶劑的干擾也導(dǎo)致反應(yīng)效率低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種透明質(zhì)酸的酯化方法，該 方法的反應(yīng)效率高、反應(yīng)時(shí)間短，且產(chǎn)物的純度高。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種透明質(zhì)酸的酯化方法，其特征在于包括以下步驟： a)取透明質(zhì)酸水溶液與四丁基氫氧化銨進(jìn)行反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)式為

b):在無(wú)水DMSO有機(jī)溶劑中，以和EDC和DMAP為催化劑，使油酸或者3-十八烷氧 基-1，2-丙二醇與化合物1進(jìn)行酯化反應(yīng)，生產(chǎn)透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物，反應(yīng)程式如下：
[0006] 本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，油酸或3-十八烷氧基-1，2-丙二醇兩者的分子式 中烷烴鏈過(guò)多使得它們極難溶于水，就算選擇DMS0和水混合的溶劑，反應(yīng)也難以進(jìn)行，因 此，為了反應(yīng)的進(jìn)行，需要選用無(wú)水的有機(jī)溶劑。另一方面，透明質(zhì)酸溶于水溶液中，但難溶 于有機(jī)溶劑中，四丁氨基修飾的透明質(zhì)酸（即本申請(qǐng)中的化合物1)在有機(jī)溶劑中的溶解度 非常高。因此，本申請(qǐng)的方案是：將鈉型透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗亩“被秃螅捎肊DC和DMAP為 酯化反應(yīng)的催化劑，讓油酸或3-十八烷氧基-1，2-丙二醇在無(wú)水DMS0有機(jī)溶劑中與四丁 氨基型透明質(zhì)酸進(jìn)行反應(yīng)，得到高純度的透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物。
[0007] 優(yōu)選地，步驟a)中透明質(zhì)酸水溶液先用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換純化，再與 四丁基氫氧化銨進(jìn)行反應(yīng)。
[0008] 優(yōu)選地，所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂經(jīng)過(guò)預(yù)處理，再與透明質(zhì)酸水溶液進(jìn)行離子交換。陽(yáng) 離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理方法是：先用超純水洗滌12h，再用0. 1M氫氧化鈉和0. 1M的鹽酸輪 流交替洗滌5h，最后再用清水洗滌成中性。
[0009] 優(yōu)選地，步驟a)的反應(yīng)在pH為6的條件下進(jìn)行?？梢圆捎盟亩』鶜溲趸@調(diào)節(jié) 反應(yīng)溶液的pH，滴加四丁基氫氧化銨直至pH為6,然后透析去除過(guò)量的四丁基氫氧化銨。
[0010] 優(yōu)選地，步驟b)油酸或3-十八烷氧基-1，2-丙二醇與化合物1混合反應(yīng)后，加入 飽和食鹽水，透析出透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物。
[0011] 優(yōu)選地，加入飽和食鹽水后，再進(jìn)一步加入無(wú)水乙醇或者乙酸直至出現(xiàn)大量白色 沉淀，再用無(wú)水乙醇或者乙酸洗滌，然后加入到水中透析出透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物。透析方法 是：先用DMS0透析1天，再用超純水透析3天，最后再進(jìn)行冷凍干燥處理。
[0012] 優(yōu)選地，步驟b)使用油酸與化合物1進(jìn)行酯化反應(yīng)時(shí)，先將油酸加入到無(wú)水DMS0 溶劑中，再加入EDC和DMP，攪拌，然后加入化合物1攪拌反應(yīng)。
[0013] 優(yōu)選地，步驟b)使用3-十八烷氧基-1，2-丙二醇與化合物1進(jìn)行酯化反應(yīng)時(shí)， 先將化合物1加入到無(wú)水DMS0溶劑中，再加入EDC和DMAP攪拌，然后加入3-十八烷氧 基-1，2-丙二醇進(jìn)行反應(yīng)。
[0014] 優(yōu)選地，步驟b)油酸或者3-十八烷氧基-1，2-丙二醇與化合物1進(jìn)行酯化反應(yīng) 時(shí)，油酸或3-十八烷氧基-1,2-丙二醇與化合物1的質(zhì)量比均為1 :(2. 5~12. 5)。油酸 或3-十八烷氧基-1，2-丙二醇的用量越多，酯化產(chǎn)物中油酸或3-十八烷氧基-1，2-丙二 醇的取代度越高。
[0015] 優(yōu)選地，步驟b)的混合有機(jī)溶劑為每15mLDMS0溶劑中加入28~84mgEDC、18~ 54mgDMAP。催化劑EDC、DMAP的用量越多，酯化產(chǎn)物中油酸或3-十八烷氧基-1，2-丙二醇 的取代度越高。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是： 1、本發(fā)明的方法可以獲得取代范圍廣、取代度高的透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物。
[0017] 本發(fā)明的方法獲得的透明質(zhì)酸酯化產(chǎn)物純度高。
[0018] 本發(fā)明的方法反應(yīng)時(shí)間短。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為透明質(zhì)酸、油酸酯化的透明質(zhì)酸和3-十八烷氧基-1，2-丙二醇酯化的透明 質(zhì)酸的紅外譜圖； 圖2為透明質(zhì)酸、油酸酯化的透明質(zhì)酸和3-十八烷氧基-1，2-丙二醇酯化的透明質(zhì)酸 的核磁譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面通過(guò)具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0021] 本發(fā)明涉及到的術(shù)語(yǔ)解釋如下： 透明質(zhì)酸：也稱乙酰透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸鹽或HA。DMS0:二甲基亞砜。EDC:二氯乙烷。DMAP:4_二甲氨基吡啶。
[0022] 實(shí)施例1 一種透明質(zhì)酸的酯化方法，具體步驟如下： (1)取500mg透明質(zhì)酸（Mw=8000)溶于20mL超純水中并攪拌12h，從而形成澄清透明 的透明質(zhì)酸溶液。
[0023] (2)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理(先用超純水洗12h，再用0. 1M氫氧化鈉和0. 1M 的鹽酸輪流交替洗滌5h，最后一遍用清水洗滌成中性)，然后將透明質(zhì)酸溶液加入到預(yù)處理 好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂攪拌lh，洗脫，過(guò)濾，收集濾液。在濾液中加入四丁基氫氧化銨使pH調(diào) 節(jié)到6左右。最后，透析（cutoff=lkDa)去除過(guò)量的四丁基氫氧化銨，冷凍干燥得到四丁基 銨修飾的透明質(zhì)酸。
[0024] (3)油酸修飾透明質(zhì)酸：油酸（100mg)加入到無(wú)水DMS0溶劑（15mL)中，并加入EDC (84mg)和DMAP(54mg)攪拌lh。然后加入四丁基銨修飾的透明質(zhì)酸（250mg)并在35°C條 件下攪拌24h，然后加入飽和食鹽水2mL再攪拌30min，透析(先用DMS0透析1天，再用超純 水透析3天)，冷凍干燥得到高取代度的油酸修飾的透明質(zhì)酸。
[0025] 實(shí)施例2 一種透明質(zhì)酸的酯化方法，具體步驟如下： (1)取500mg透明質(zhì)酸（Mw=22000)溶于20mL超純水中并攪拌12h，從而形成澄清透明 的透明質(zhì)酸溶液。
[0026] (2)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理(先用超純水洗12h，再用0. 1M氫氧化鈉和0. 1M 的鹽酸輪流交替洗滌5h，最后一遍用清水洗滌成中性)，然后將透明質(zhì)酸溶液加入到預(yù)處理 好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂攪拌lh，洗脫，過(guò)濾，收集濾液。在濾液中加入四丁基氫氧化銨使pH調(diào) 節(jié)到6左右。最后，透析（cutoff=lkDa)去除過(guò)量的四丁基氫氧化銨，冷凍干燥得到四丁基 銨修飾的透明質(zhì)酸。
[0027] (3)油酸修飾透明質(zhì)酸：油酸（100mg)加入到無(wú)水DMS0溶劑（15mL)中，并加入EDC (84mg)和DMAP(54mg)攪拌lh。然后加入四丁基銨修飾的透明質(zhì)酸（250mg)并在并在35°C 條件下攪拌24h，并加入飽和食鹽水2mL攪拌30min，再加入5mL無(wú)水乙醇(或者乙酸)，出現(xiàn) 大量白色沉淀過(guò)濾并用無(wú)水乙醇(或者乙酸)洗滌2次，并加入到水中透析，冷凍干燥得到取 代度比較高的油酸修飾的透明質(zhì)酸。
[0028] 實(shí)施例3 一種透明質(zhì)酸的酯化方法，具體步驟如下： (1)取500mg透明質(zhì)酸（Mw=8000)溶于20mL超純水中并攪拌12h，從而形成澄清透明 的透明質(zhì)酸溶液。
[0029] (2)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理(先用超純水洗12h，再用0. 1M氫氧化鈉和0. 1M 的鹽酸輪流交替洗滌5h，最后一遍用清水洗滌成中性)，然后將透明質(zhì)酸溶液加入到預(yù)處理 好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂攪拌lh，洗脫，過(guò)濾，收集濾液。在濾液中加入四丁基氫氧化銨使pH調(diào) 節(jié)到6左右。最后，透析（cutoff=lkDa)去除過(guò)量的四丁基氫氧化銨，冷凍干燥得到四丁基 銨修飾的透明質(zhì)酸。
[0030] (3)油酸修飾透明質(zhì)酸：油酸（20mg)加入到無(wú)水DMS0溶劑（15mL)中，并加入EDC (28mg)和DMAP(18mg)攪拌lh。然后加入四丁基銨修飾的透明質(zhì)酸（250mg)并在35°C條 件下攪拌24h，然后加入飽和食鹽水2mL再攪拌30min，透析(先用DMS0透析1天，再用超純 水透析3天)，冷凍干燥得到低取代度的油酸修飾的透明質(zhì)酸。
[0031] 實(shí)施例4 一種透明質(zhì)酸的酯化方法，具體步驟如下： (1)取500mg透明質(zhì)酸（Mw=22000)溶于20mL超純水中并攪拌12h，從而形成澄清透明 的透明質(zhì)酸溶液。
[0032] (2)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理(先用超純水洗12h，再用0. 1M氫氧化鈉和0. 1M 的鹽酸輪流交替洗滌5h，最后一遍用清水洗滌成中性)，然后將透明質(zhì)酸溶液加入到預(yù)處理 好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂攪拌lh，洗脫，過(guò)濾，收集濾液。在濾液中加入四丁基氫氧化銨使pH調(diào) 節(jié)到6左右。最后，透析（cutoff=lkDa)去除過(guò)量的四丁基氫氧化銨，冷凍干燥得到四丁基 銨修飾的透明質(zhì)酸。
[0033] (3)油酸修飾透明質(zhì)酸：油酸（20mg)加入到無(wú)水DMS0溶劑（15mL)中，并加入EDC (28mg)和DMAP(18mg)攪拌lh。然后加入四丁基銨修飾的透明質(zhì)酸（250mg)并在35°C條 件下攪拌24h，并加入飽和食鹽水2mL攪拌30min，再加入5mL無(wú)水乙醇(或者乙酸)，出現(xiàn)大 量白色沉淀過(guò)濾并用無(wú)水乙醇(或者乙酸)洗