聚乙二醇1000維生素e琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇三嵌段聚合物及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于高分子聚合物領(lǐng)域，尤其涉及聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙 烯亞胺-膽固醇三嵌段聚合物及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯（TPGS)是由維生素E琥珀酸酯的羧基與聚乙二 醇（PEG) 1000的羥基酯化而成，是經(jīng)FDA認(rèn)證的安全高分子材料，且TPGS已經(jīng)載入《美國 藥典》。聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯分子結(jié)構(gòu)有親水基團(tuán)和親油基團(tuán)而有表面活性， 且因其獨(dú)特的性質(zhì)，被用作增溶劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑等。因TPGS具有兩親性及良好的水 溶性，對(duì)水難溶性和親脂性藥物來說是個(gè)很理想的非離子性表面活性劑。美國Eastman是 最早開發(fā)TPGS并上市的公司，聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯現(xiàn)在在藥物制劑研究中已 經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。聚乙二醇（PEG)作為藥物載體，具有體內(nèi)長循環(huán)、延長半衰期、提高 藥物的細(xì)胞攝取等優(yōu)點(diǎn)。TPGS除了擁有PEG的優(yōu)點(diǎn)外，在藥物傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用中還具有更 大的優(yōu)勢：首先，TPGS可以顯著提高藥物包封率，從而能增強(qiáng)藥物的細(xì)胞攝取，增加癌細(xì)胞 的死亡率；其二，與其他表面活性劑相比，TPGS具有生育酚酯的結(jié)構(gòu)，從而有一定的抗氧化 性，這有助于增加制劑的穩(wěn)定性；其三，可應(yīng)用于前藥設(shè)計(jì)，提高生物利用度；其四，有很多 報(bào)道聲稱，TPGS是一種P-糖蛋白抑制劑，它通過與P-糖蛋白上非轉(zhuǎn)運(yùn)活性位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致 P-糖蛋白構(gòu)象改變，進(jìn)而喪失轉(zhuǎn)運(yùn)功能。轉(zhuǎn)運(yùn)受P-糖蛋白阻滯的藥物，如阿霉素、紫杉醇、 長春堿、秋水仙堿等，與TPGS合用后，都能明顯增加藥物在胃腸道內(nèi)的吸收，提高其生物利 用度。
[0003] 聚乙烯亞胺（PEI)，為富含氮原子的陽離子高分子材料，分子量范圍寬，多為lKDa到lOOOKDa之間，結(jié)構(gòu)骨架（-CH2-CH2-NH_)中每3個(gè)原子含有一個(gè)氨基，與聚賴氨酸（PLL) 及樹枝狀高分子（PAMAM)具有類似性質(zhì)。聚乙烯亞胺（PEI)是轉(zhuǎn)染效率較高的陽離子聚合 物之一，被廣泛用作DNA、寡核苷酸和siRNA等基因藥物的陽離子聚合物載體系統(tǒng)。它分為 線狀和分枝狀兩種分子結(jié)構(gòu)，均可在生理?xiàng)l件下發(fā)生質(zhì)子化，使得PEI具有較高的正電荷 密度，其帶正電荷的氨基基團(tuán)與核酸帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過靜電吸附作用而發(fā)生電性中 和，能夠有效地壓縮帶有負(fù)電荷的DNA，形成穩(wěn)定的納米-核酸復(fù)合物，保護(hù)DNA免受血裝 中DNA酶的降解，表面電荷呈中性或弱陽性，與表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用而進(jìn)入細(xì) 胞內(nèi)，具有較高的靶向性和轉(zhuǎn)染效率。PEI的作用機(jī)制是當(dāng)其攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞后，在酸性 內(nèi)涵體內(nèi)發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致離子內(nèi)流，使得內(nèi)涵體膨脹而破裂，即"質(zhì)子海綿效應(yīng)"，從而釋 放出PEI/DNA復(fù)合物，促進(jìn)DNA向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。理想的非病毒載體基因遞 送系統(tǒng)能夠有效地規(guī)避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬和血漿中DNA酶的降解，穿透細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)內(nèi) 涵體的逃逸，從而成功地將DNA帶入細(xì)胞核。聚乙烯亞胺（PEI)是一種廣泛研究的用于基 因遞送的非病毒載體，其主要優(yōu)勢具有良好的體外轉(zhuǎn)染效果。然而隨著PEI分子量的增加， 其潛在的細(xì)胞毒性也明顯增大，尤其是平均分子量為25000的PEI。其次PEI體內(nèi)穩(wěn)定性 差，容易和血漿蛋白結(jié)合，從而被快速消除。由于這些缺點(diǎn)的存在，限制了PEI的應(yīng)用。據(jù)文 獻(xiàn)報(bào)道，將親水性的多聚物如PEG修飾在PEI上，能夠顯著改善其PEI的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。 PEG化后的PEI/DNA復(fù)合物降低了表面正電荷，從而降低了PEI與血漿蛋白的作用，延長了 在血液中循環(huán)的時(shí)間，同時(shí)也降低了毒性。
[0004] 膽固醇（cholesterol)，又名膽甾醇，分子式為C27H460,它以醇或脂肪酸酯的形式 存在于所有動(dòng)物的細(xì)胞中，尤其存在于腦和脊髓中。膽固醇為具有旋光性的白色結(jié)晶固體。 膽固醇是一切動(dòng)物細(xì)胞作為細(xì)胞膜構(gòu)造物的物質(zhì)，使細(xì)胞膜能夠"識(shí)別"并對(duì)通透細(xì)胞膜的 物質(zhì)進(jìn)行選擇，讓代謝廢物透出膜外，而將維持細(xì)胞生命的有益物質(zhì)保持。這些功能都基于 膽固醇特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)、構(gòu)型以及電荷分布。膽固醇作為生物膜的重要組成部分，能調(diào)節(jié)生 物膜的流動(dòng)性，在相變溫度以下增加生物膜的流動(dòng)性；在相變溫度以上能減小生物膜的流 動(dòng)性。此外，膽固醇還具有增加生物膜機(jī)械強(qiáng)度和減小生物膜滲透性的功能。生物分子膽 固醇作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞重要組成部分之一，已被譽(yù)為"生物學(xué)中最具裝飾性的小分子"。膽 固醇分子由于其高度的疏水性留醇骨架，良好的生物降解性和生物相容性，使得其是許多 水溶性聚合物疏水改性的最佳選擇之一。膽固醇疏水改性的兩親性聚合物的自組裝體系在 藥物遞送的應(yīng)用方面近年來也受到越來越多的關(guān)注。
[0005] 基因治療是將人正常的或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞來干預(yù)疾 病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程，包括替代或糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的缺陷或錯(cuò)誤，殺滅病變 的細(xì)胞或增強(qiáng)機(jī)體清除病變細(xì)胞的能力等，從而達(dá)到治療的目的。在基因治療的實(shí)施中，有 四個(gè)重要的環(huán)節(jié)：一是尋找有效治療基因，二是研制可以攜帶基因進(jìn)入靶細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的 有效安全的轉(zhuǎn)基因載體體系，三是選擇合適有效的轉(zhuǎn)基因途徑，四是如何使治療基因在靶 細(xì)胞中特異性表達(dá)，發(fā)揮有效治療作用。其中缺乏有效安全的轉(zhuǎn)基因載體體系是制約基因 治療實(shí)施的一個(gè)主要瓶頸。目前基因治療使用最多的轉(zhuǎn)基因載體是腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體，約占治療使用載體總數(shù)的50%。病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)基因效率，但使用病毒載體有許 多缺點(diǎn)，主要包括病毒載體有較強(qiáng)的免疫原性，大量使用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。此外病毒 載體的應(yīng)用還有出現(xiàn)插入突變的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，而且病毒載體有限 的攜帶DNA能力，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)也是限制其應(yīng)用的主要缺點(diǎn)。非病毒載體與病毒載 體相比，其優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在非病毒載體很低免疫原性，不具備插入突變的能力，易于大規(guī)模 生產(chǎn)和生產(chǎn)成本較低。但非病毒載體的最大缺點(diǎn)是其轉(zhuǎn)基因效率較低。理想的非病毒轉(zhuǎn)基 因載體應(yīng)該是可以降解的，毒性很低的，有較高轉(zhuǎn)基因效率，并且具備靶向到目標(biāo)細(xì)胞或是 組織的能力，使治療基因在靶細(xì)胞或組織中發(fā)揮作用。
[0006] 因此，研究同時(shí)具有轉(zhuǎn)基因效率高、可降解、毒性低的兩親性嵌段聚合物非病毒轉(zhuǎn) 基因載體具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因效率高、可降解、毒性低的具有兩親性的 聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇三嵌段聚合物。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽 固醇三嵌段聚合物的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽 固醇三嵌段聚合物在非病毒轉(zhuǎn)基因載體中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種非病毒轉(zhuǎn)基因載體。
[0011] 一種聚乙二醇1〇〇〇維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇三嵌段聚合物，其具 有式（1)所述的結(jié)構(gòu)式：
[0013]其中，η為 116-348 的整數(shù)，X為 20-25,Y為 3。
[0014] 本發(fā)明所述聚乙二醇1000維生素Ε琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇嵌段聚合物 生物相容性效果好，生物降解性好，毒性低。
[0015] 所述聚乙二醇1000維生素Ε琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇嵌段聚合物的重均 分子量優(yōu)選為56400-78000Da，此種重均分子量的聚合物具有良好的溶解性，穩(wěn)定性，適宜 的Zeta電位值。
[0016] -種制備聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇嵌段聚合物的 方法，主要包括如下步驟：
[0017] (a)聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與?；噭┓磻?yīng)，得到活化聚乙二醇1000維 生素E琥珀酸酯；
[0018] (b)聚乙烯亞胺與膽固醇氯甲酸酯反應(yīng)，得到聚乙烯亞胺-膽固醇；
[0019] (c)所述活化的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與所述聚乙烯亞胺-膽固醇反 應(yīng)，得到聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯-聚乙烯亞胺-膽固醇嵌段聚合物。
[0020] 其中，步驟（a)中，聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯的端羥基在?；瘎┑淖饔孟?發(fā)生?；磻?yīng)。所述?；噭閷?duì)硝基苯基氯甲酸酯、丁二酸酐中的一種，優(yōu)選為對(duì)硝基苯 基氯甲酸酯。
[0021] 步驟（a)的操作優(yōu)選為：按照聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯與酰化劑的摩爾比 為1 :(1-2)使二者反應(yīng)，得到粗產(chǎn)品溶液；向所述粗產(chǎn)品溶液中加入有機(jī)溶劑沉淀得到化 合物粗品，洗滌并干燥所述粗品，即得活化聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯。
[0022] 由于酰化反應(yīng)速率緩慢，因此，優(yōu)選在反應(yīng)體系中加入催化劑加快反應(yīng)進(jìn)程，所述 催化劑優(yōu)選為二甲基氨基吡啶（DMAP)、吡啶中的一種或兩種。
[0023] 步驟（a)的一種具體反應(yīng)歷程為：
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