一種表達(dá)重組vegf融合蛋白的基因工程菌的構(gòu)建的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 在基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種新的融合蛋白重組工程菌及其構(gòu)建方法，以 及該融合蛋白的純化。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組質(zhì)粒指的是在基因工程的領(lǐng)域，在體外將目的基因和載體結(jié)合成一個具有自 我復(fù)制能力的DNA分子，繼而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主菌株或細(xì)胞，篩選出含目的基因的重組子。 融合蛋白技術(shù)是為了獲得目標(biāo)蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因重組和蛋白表達(dá)的方法。利用 融合蛋白技術(shù)，可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新型目的蛋白。
[0003] 腫瘤疫苗按抗原成分的類型可分為腫瘤細(xì)胞型疫苗、腫瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和樹突狀細(xì)胞疫苗等。無論何種類型的腫瘤疫苗，其研制的關(guān)鍵都在于選擇合適的 靶抗原和提高免疫原性。
[0004] 腫瘤細(xì)胞會表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原，針對這些抗原發(fā)展起來的腫瘤 特異性免疫治療，是腫瘤生物治療的重要方法。
[0005] 腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associatedantigen，TAA):指并非某一種腫瘤所特有，在 其他腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞上也存在的抗原分子。正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞僅在增殖中有量的差 異，因此稱為相關(guān)抗原。
[0006] 血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor)是最重要的血管內(nèi) 皮細(xì)胞刺激因子，它可與血管內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、迀移，誘 導(dǎo)新生血管形成，提高血管通透性，使腫瘤持續(xù)生長。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均高水平表達(dá)VEGF， 而正常組織中僅腎、卵巢等少數(shù)臟器有較高水平的表達(dá)，因此VEGF是抗腫瘤血管治療理想 的靶部位。VEGFm突變體I是本實驗室用破傷風(fēng)毒素兩個強(qiáng)T輔助表位618-627和831-838 替換hVEGF121的1-8和115-121兩個肽段。結(jié)果說明在保持半胱氨酸結(jié)原有二聚體結(jié)構(gòu)的 前提下，破傷風(fēng)毒素兩個強(qiáng)T輔助表位hVEGF非關(guān)鍵殘基置換后，可有效提高VEGF的免疫 原性。
[0007] 胃泌素釋放肽（gastrin-releasingpeptide，GRP)是哺乳動物中的娃皮素同系 物，為一種胃腸道神經(jīng)激素，含有27個氨基酸，具有生長因子樣作用。通過自分泌或旁分泌 途徑，GRP可以刺激腫瘤細(xì)胞的生長，參與腫瘤新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移等。GRP及 其受體在多種腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)，在有限的正常組織中有少量的分布，因此GRP及其 受體是腫瘤治療的理想靶點。GRP的C端7至8個氨基酸就是其抗原表位，因此我們選擇 GRP的C端十肽可以完全覆蓋GRP的表位?？乖砦欢嚯闹貜?fù)多次，可以增加抗原表位的劑 量，增加整個抗原的分子量，從而增加抗原表位多肽的免疫原性。
[0008] 由于單獨(dú)用VEGF或GRP免疫原性相對較低，本發(fā)明將VEGFmI-M2基因同GRP基 因連接起來，組建pET28a-VEGF1，2-61^6重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，將其作為疫苗刺激 機(jī)體產(chǎn)生主動免疫，打破免疫耐受，產(chǎn)生針對VEGF和GRP特異性肽段的抗體，從而抑制腫 瘤的生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明公開一種表達(dá)重組VEGF融合蛋白的基因工程菌。
[0010] 本發(fā)明的一個目的是提供該重組菌的制備方法，方法簡便，易于操作。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是公開該重組蛋白的純化方法。
[0012] 在本發(fā)明的第一個方面，該大腸桿菌菌株命名為Escherichia coli BL21(DE3)/ VG6:pET28a-VEGF I-M2-GRP6，菌株已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國、武 漢、武漢大學(xué)。保藏日期：2015年8月21日，保藏編號為CCTCC N0:M2015497,分類命名為 Escherichia coli BL21(DE3)/VG6,其細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6,質(zhì)粒中 含有SEQ ID NO. 1所示的重組突變VEGF基因序列。
[0013] 在本發(fā)明的第二個方面，提供了該重組質(zhì)粒的制備方法，其技術(shù)路線詳述如下：
[0014] 1.重組質(zhì)粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建
[0015] 根據(jù)本實驗室已有的關(guān)于重組質(zhì)粒pET28a-HSP65-GRPf^P pET28a-VEGF I-M2的序 列信息，利用引物設(shè)計軟件Primer5和oligo7來設(shè)計上游引物VI、V2和下游引物Gl、 G2。上游引物VI中引入NcoI，NheI酶切位點以及DPTGG連接肽序列。采用PCR技術(shù)從 pET28a-VEGF I-M2質(zhì)粒中克隆得到基因VEGF I-M2-DP TGG，以及從pET28a-HSP65-GRP6質(zhì) 粒中克隆得到GRP6基因。通過酶切、酶連和轉(zhuǎn)化技術(shù)將PCR的產(chǎn)物VEGF I-M 2-DPTGG插入 pET-28a質(zhì)粒載體的相應(yīng)酶切位點中，再將GRP6基因轉(zhuǎn)入剛轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒中組成重組質(zhì) 粒pET28a-VEGF I-M2-GRP6，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21獲得需要的重組基因的 工程菌。
[0016] 2.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0017] 將重組工程菌進(jìn)行活化，接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，按 1 : 100轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至A600值為0. 6-0. 8時，加入乳糖（終濃度 7mM)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，7h后離心收取菌體沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白條帶 位置和表達(dá)量。
[0018] 3.融合蛋白的分離純化
[0019] 收集菌體，每克濕菌體加入10mL菌體裂解緩沖液溶解，再進(jìn)行超聲裂解操作，充 分裂解菌體；離心收集沉淀。將沉淀先用包涵體洗滌液A溶解，室溫磁力攪拌30min，離 心取沉淀；再分別用包涵體洗滌液B和雙蒸水溶解，重復(fù)上述洗滌步驟，去除部分雜蛋白 和核酸。將沉淀加入包涵體裂解液，4°C攪拌過夜溶解，離心收集上清。將上清用梯度復(fù) 性法進(jìn)行復(fù)性，最后用層析緩沖液于4°C充分透析，離心棄沉淀，上清液過陰離子交換柱 DEAE-cellulose做進(jìn)一步純化，用濃度梯度為0-1MNaCl層析緩沖液梯度洗脫，收集洗脫 峰，檢測合并目的蛋白峰組分，對蒸餾水充分透析后凍干保存。
【附圖說明】
[0020] 圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建原理示意圖。
[0021] 圖2 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物VEGF121I-M2_DPTGG基因的結(jié)果。
[0022] Lanel :Protein Marker，Lane2 :VEGF121I_M2-DPTGG基因
[0023] 圖3 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物GRP6基因的結(jié)果。
[0024]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :GRP6基因
[0025] 圖4攜帶VEGF121I-M2-DPTGG基因的pET28a質(zhì)粒正向測序圖
[0026] 圖5 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物VEGF121I-M2-GRP6基因的結(jié)果。
[0027]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :VEGF121I_M2-GRP6基因
[0028] 圖6重組質(zhì)粒的基因正向測序圖。
[0029] 圖7 15%SDS-PAGE電泳檢測重組菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的誘導(dǎo)曲線。
[0030]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :誘導(dǎo)前的全菌蛋白樣品，Lane3_10 :誘導(dǎo)后l_8h 每個小時的全菌蛋白樣品
[0031] 圖8 15%SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白破碎后圖。
[0032]Lanel:誘導(dǎo)前全菌蛋白，Lane2 :誘導(dǎo)后6h全菌蛋白，Lane3 :菌體離心后上清， Lane4 :菌體離心后沉淀，Lane5 :超聲破碎后取樣，Lane6 :超聲破碎后離心上清，Lane7 :超 聲破碎后沉淀
[0033] 圖9 15%SDS-PAGE電泳檢測蛋白梯度復(fù)性
[0034]Lanel:ProteinMarker，Lane2 :8M尿素溶解上清，Lane3 :4M尿素透析外液， Lane4 :4M尿素透析內(nèi)液，Lane5 :2M尿素透析外液，Lane6 :2M尿素透析內(nèi)液，Lane7 :1M尿 素透析內(nèi)液，Lane8 :Tris_HCL透析內(nèi)液，Lane9:Tris-HCL透析外液
【具體實施方式】
[0035] 材料
[0036](1)菌株
[0037]載體pET28a-HSP65-GRP6,EscherichiacoliBL21(DE3)，菌株pET28a-VEGF121I-M2 均為本實驗室保存。
[0038](2)酶和試劑
[0039] 分子克隆工具酶為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物科技有 限公司；產(chǎn)物純化試劑盒以及PCR膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產(chǎn)品。
[0040] (3)培養(yǎng)基
[0041]LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)SambrookJ，F(xiàn)ristshEF，ManiatisT.Molecular Cloning；ALaboratoryManual2nded.NY：ColdSpringHarborLaboratoryPress， 1989〇
[0042] 本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、PCR產(chǎn)物的回收、連 接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見SambrookJ， FristshEF，ManiatisT.MolecularCloning；ALaboratoryManual2nded.NY：Cold SpringHarborLaboratoryPress，1989,pp.16-340。
[0043] 實施例1VEGF121I-M2_GRP6基因的克隆
[0044] 根據(jù)本實驗室已構(gòu)建的關(guān)于pET28a-VEGFmI_M2的序列信息，利用引物設(shè)計軟件 primer、oligo分別設(shè)計兩對引物VI、V2 :
[0045]VI:5, -CATGCCATGGACATCATCGACGACT-3'
[0046]V2 :5, -CGGCTAGCGCCACCAGTCGGATCCTTGTTGTGAGCGGCAA-3，
[0047] 上游引物VI中引入酶切位點NcoI，下游V2中引入酶切位點NheI以及柔性肽 DPTGG。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET28a-VEGF121 I-M2和質(zhì)粒pET28a。利用引物V1、V2克隆VE