一種新型的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種胞外核酸酶及其用途，特別涉及一種新型的結(jié)核分枝桿菌胞外核 酸酶及其用途，本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 許多種細(xì)菌能產(chǎn)生胞外核酸酶，胞外核酸酶對于細(xì)菌的毒力、生物被膜的形成、利 用胞外DNA獲取營養(yǎng)和降解胞外誘捕網(wǎng)（NETs)中的DNA中起著重要作用。比如希瓦氏 菌、沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌的胞外核酸酶能夠降解胞外的DNA以獲取其基本的營養(yǎng)成 分-磷源，碳源和氮源。Seper的最近研究表明野生型的霍亂弧菌能通過其本身的兩種胞外 核酸酶（Dns和Xds)降解NETs中的DNA成分。金黃色葡萄球菌的胞外核酸酶也能降解NETs， 進(jìn)而引發(fā)半胱天冬酶-3介導(dǎo)的免疫細(xì)胞死亡。然而無乳鏈球菌的胞外核酸酶（Gbs0661) 能夠攻擊NETs并且是細(xì)菌毒力所必須的。（NETs-中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)是宿主的防御反 應(yīng)中一個重要組成部分，能夠固定微生物隨后并清楚）。在葡萄糖缺乏的培養(yǎng)基中，枯草芽 孢桿菌168的孢子形成階段釋放的脫氧核糖核酸酶（NucB)能夠降解生物被膜的重要核酸 為自身利用。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis)是革蘭氏陽性細(xì)菌，是引起結(jié)核病的病原菌。結(jié) 核病一直是世界上死亡率最高的疾病之一。2013年，大約有900萬人感染結(jié)核病，約有150 萬人死于這種疾病，其中36萬人是HIV陽性。結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入肺之后，被巨噬細(xì)胞和樹 突狀細(xì)胞所吞噬，然而結(jié)核分枝桿菌能夠在這些免疫細(xì)胞中擴(kuò)散，甚至逃脫這些吞噬體迀 移到淋巴結(jié)而擴(kuò)散感染。
[0004] 革蘭氏陽性細(xì)菌的胞外核酸酶在細(xì)菌的毒力和降解胞外誘捕網(wǎng)（中性粒細(xì)胞或 者巨噬細(xì)胞釋放）的DNA方面起著非常重要的作用。之前有關(guān)胞外核酸酶的研究主要集中 在無乳鏈球菌，化膿性鏈球菌和金黃色葡萄球菌。雖然之前報道描述過結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi) 核酸酶，但是至今沒有數(shù)據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌存在胞外核酸酶。在次，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并證 實Rv0888蛋白是結(jié)核分枝桿菌的胞外核酸酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種新型的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶及其用途。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種能夠抑制所述結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶的抑制 劑。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0008] 在本發(fā)明中，我們證實了Rv0888蛋白是第一個來自于結(jié)核分枝桿菌的胞外核酸 酶，屬于endonuclease/exonuclease/phosphatase家族（PfamfamilyPF03372)，在結(jié)核分 枝桿菌的培養(yǎng)濾液中能檢測到鞘磷脂酶的活性。進(jìn)一步的，本發(fā)明還證明了該胞外核酸酶 在降解不同類型的核酸（基因組DNA，雙鏈PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒DNA和面包酵母RNA)方面具有高 度的活性，Rv〇888發(fā)揮其核酸酶活性需要二價離子的輔助（Ca2+和Mn2+)。另外四種中藥單 體（6-姜酚，類葉升麻苷，橄欖苦苷，補(bǔ)骨脂乙素）能夠抑制Rv0888的核酸酶活性。
[0009] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了一種新型的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶，命名為Rv0888， 其氨基酸序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 3或SEQIDN0. 5所示。
[0010] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了編碼所述的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶的核苷酸序列。 優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQIDN0. 2、SEQIDN0. 4或SEQIDN0. 6所示。
[0011] 含有所述的核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也自然落在 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶在降解核酸中的用 途。
[0013] 其中，優(yōu)選的，所述的核酸包括線性雙鏈DNA，環(huán)狀質(zhì)粒DNA，染色體DNA或者RNA。
[0014] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了橄欖苦苷，6-姜酚，補(bǔ)骨脂乙素或類葉升麻苷在抑制所 述的結(jié)核分枝桿菌胞外核酸酶中的用途。
[0015]Rv0888核酸酶活性顯示在33°C-51°C的溫度范圍內(nèi)，最佳的溫度是41°C。這個溫 度與人和動物在感染結(jié)核分枝桿菌后體溫升高是一致的，表明Rv〇888也許與結(jié)核分枝桿 菌的毒力有關(guān)。與其他的脫氧核糖酸酶/核酸酶相似，Rv〇888核酸酶發(fā)揮活性也需要二價 離子。最佳的二價離子是Mn2+以及Ca2+，其他的二價離子（Mg2+，Ba2+，Ni2+)也有不同程度的 促進(jìn)作用（表1)。這些結(jié)果表明與之前報道的大腸桿菌核酸酶一樣，Rv〇888的催化活性位 點與二價離子的直徑?jīng)]有關(guān)系，而是這些離子結(jié)合在不同的氨基酸維持其活性。金屬螯合 劑EDTA對Rv0888的活性起著很強(qiáng)的抑制效果，表明金屬離子對于核酸活性是必須的，并且 在酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著非常重要的作用。
[0016] 氨基酸置換研究表明D438位氨基酸在Rv0888核酸酶活性方面起著關(guān)鍵的作用， H353和D387在Rv0888活性方面也起著比較積極的作用。與其他的含有保守基序的DRGH 的肺炎鏈球菌胞外核酸酶EndA22和DKGH的無乳鏈球菌的胞外核酸酶Gbs06616相比，這些 重要的氨基酸殘基與他們是不同的。Rv〇888蛋白與其他已知的核酸酶沒有任何同源性（圖 9)，因此我們的數(shù)據(jù)表明Rv0888是一個非特異性核酸酶家族成員之一。
[0017]由于肺結(jié)核與HIV共感染和新出現(xiàn)的無法治療的或者廣泛耐藥的結(jié)核分枝桿菌， 使得肺結(jié)核很難控制。迫切需要研發(fā)新的藥物和更有效的疫苗。因此需要在遺傳基礎(chǔ)上理 解結(jié)核分枝桿菌的毒力和致病性。有趣的是四種中藥單體（橄欖苦苷，類葉升麻苷，6-姜 酚，補(bǔ)骨脂乙素）能夠抑制Rv〇888活性。之前有關(guān)抑制劑的研究主要集中在小分子抑制 劑，主要是蛋白和病原體生物合成相關(guān)的因子：例如，結(jié)構(gòu)同源物ML141阻止金黃色葡萄球 菌進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞；半胱氨酸蛋白酶抑制劑K11777阻塞冠狀病毒和線狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞； 在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的ItaS表達(dá)過程中，化合物1771能阻塞磷脂酰甘油-LtaS 的結(jié)合和抑制LTA的合成；使用BAS00127538抑制鮑曼不動桿菌LipidII( -個細(xì)胞壁生 物合成的前體）通過。隨后的藥物研究轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁蛋白和蛋白酶上：分選酶抑制劑能夠 用于治療醫(yī)院內(nèi)感染的金黃色葡萄球菌的感染而沒有標(biāo)準(zhǔn)抗生素的副作用；結(jié)核分枝桿菌 磷脂酶/硫酯酶（Rv3802c)抑制劑奧利司他；通過有機(jī)催化獲得的肺結(jié)核的一個毒力因子 mPTPB的抑制劑；六種小分子被證實能夠抑制肺炎鏈球菌表面核酸酶EndA31 ;重要的是，我 們首次報道了中藥單體能有效的抑制細(xì)菌的核酸酶。現(xiàn)在對于廣泛耐藥的病原體，新藥研 究逐漸轉(zhuǎn)向中藥。因此驗證新的毒力因子并且篩選中藥抑制劑，也許有利于我們發(fā)現(xiàn)新的 治療結(jié)核病的藥物。
[0018] 體內(nèi)感染試驗表明重組恥垢分支桿菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠感染17d 時繼續(xù)在肺中持留，組織病理學(xué)分析顯示感染7d時小鼠的肺有明顯的病理變化，這就意味 著Rv0888也許是結(jié)核分枝桿菌的一個毒力因子，可能與結(jié)核分枝桿菌在宿主肺中的持留 有關(guān)。之前研究已經(jīng)報道了不同細(xì)菌核酸酶在細(xì)菌中定位：化膿性鏈球菌分泌到培養(yǎng)上清， 肺炎鏈球菌的核酸酶定位在膜上和化膿性鏈球菌，豬鏈球菌定位在肽聚糖上。結(jié)核分枝桿 菌Rv0888含有信號肽并且能分泌到培養(yǎng)液中。這種分泌的形式比定位在膜上的核酸酶-像 肺炎鏈球菌EndA-對于結(jié)核分枝桿菌的致病性更有效，因為它們更容易接近它們的底物。 在這項研究中Rv〇888核酸酶的特性使我們更容易理解結(jié)核分枝桿菌的致病性并且也許對 于我們獲得新的治療結(jié)核病的藥物具有幫助作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為重組Rv0888蛋白純化和質(zhì)譜驗證；
[0020] (A)Rv0888 蛋白親和純化的SDS-PAGE分析 20mMTris-HCl-150mMNaCl-10 % glycerol含有濃度梯度的咪唑洗脫Rv0888蛋白。l:500mM咪唑；2:200mM咪唑；3:100mM咪 唑；4:80mM咪唑；5:70mM咪唑；6:60mM咪唑；7:40mM咪唑；8:20mM咪唑；M:蛋白分子質(zhì)量 Marker。（B)離子交換層析純化Rv0888蛋白。（C)凝膠過濾層析純化Rv0888蛋白。（D) Rv0888蛋白通過基質(zhì)輔助的激光解析離子分行時間質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖譜。與Rv0888蛋白 匹配一致的序列框內(nèi)顯示。
[0021 ] 圖2為純化的Rv0888蛋白消化不同的核酸；
[0022] 反應(yīng)條件為：20mMTris-HClpH7. 5and5mMMgC1237°C孵育 1 小時。（A)純化的 Rv0888 蛋白消化不同DNAJzDLSOOODNAMarker;l:染色體DNA與 20mMTris-HCl(pH7.5); 2:染色體DNA和純化的Rv0888 ;3:環(huán)狀質(zhì)粒DNA與20mMTris-HCl(pH7. 5) ;4:環(huán)狀質(zhì)粒 DNA與純化的Rv0888 ;5:線性雙