一種高效纖維素酶混合物的生產(chǎn)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效纖維素酶混合物的生產(chǎn)方法及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶來源廣泛、成分復(fù)雜，廣泛存在于昆蟲體、軟體動(dòng)物體以及真菌、細(xì)菌與 放線菌等微生物的代謝產(chǎn)物中，主要生產(chǎn)途徑是微生物發(fā)酵，其中以絲狀真菌和細(xì)菌纖維 素酶應(yīng)用最為廣泛，目前主要還是利用真菌來發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。
[0003] 在細(xì)菌中大多數(shù)好氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌都富含豐富的纖維素酶系，特別是瘤胃中富 含多種纖維素降解酶系的厭氧菌。世界纖維素市場(chǎng)中的纖維素酶有20 %來自木霉屬和曲 霉屬。主要是由于絲狀真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的分 離和提?。虎诋a(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理；③同時(shí)可產(chǎn)生許多半纖 維素酶、果膠酶、淀粉酶等。纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶系，酶系由三類功能不同但又互補(bǔ)的酶 組成。這三類酶分別是內(nèi)切葡聚糖酶（EG，Cx酶，又稱CMC酶）、外切葡聚糖酶（纖維二糖 水解酶，CBH，C1酶）和β-葡萄糖苷酶（BGL，纖維二糖酶）；大多數(shù)編碼纖維素酶的基因是 染色體基因。纖維素酶系降解原理目前尚無定論，主要有三種作用機(jī)理：協(xié)同理論、碎片假 說和原初反應(yīng)假說，其中以協(xié)同理論被大部分研究學(xué)者和專家所認(rèn)可，其主要觀點(diǎn)為內(nèi)切 葡聚糖這類酶首先作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)識(shí)別并水解β-1，4-糖苷鍵， 將長(zhǎng)鏈纖維素分子截?cái)啵a(chǎn)生大量非還原性末端。然后外切葡聚糖酶逐個(gè)切下纖維素的非 還原末端水解產(chǎn)生纖維二糖；而葡萄糖苷酶則水解纖維二糖生成葡萄糖。三者缺一不 可，協(xié)同作用，也只有在合適的比例和組成下，才能共同作用快速實(shí)現(xiàn)纖維素的完全水解。
[0004] 我國(guó)對(duì)纖維素酶的研究和生產(chǎn)也已開展了廣泛的研究，但大多采用固體發(fā)酵方 式，固體發(fā)酵雖有許多優(yōu)越之處，但仍有發(fā)酵水平不穩(wěn)定，不適于大規(guī)模生產(chǎn)等弊端，因此 對(duì)纖維素酶液體深層發(fā)酵的研究很有意義。纖維素酶發(fā)酵過程容易受到碳水化合物阻遏效 應(yīng)（CCR)對(duì)酶發(fā)酵合成的影響，即在半纖維素和/或纖維素酶合成過程中，往往由于培養(yǎng) 基中存在著葡萄糖、木糖等單糖而通過碳水化合物阻遏效應(yīng)（CCR)抑制了酶的合成。專利 CN200910091968提供了一種高產(chǎn)纖維素酶的方法，通過補(bǔ)料和溶氧對(duì)控制發(fā)酵過程菌體濃 度來實(shí)現(xiàn)纖維素酶發(fā)酵酶活力的提高發(fā)酵，其補(bǔ)料為非常復(fù)雜的成分，包括價(jià)格昂貴的槐 糖、乳糖等及多種微量元素，同時(shí)其培養(yǎng)基成本較為昂貴。如何既能解決液體深層發(fā)酵后期 營(yíng)養(yǎng)的快速需求和固體基質(zhì)降解速率慢的問題，又能解決補(bǔ)加葡萄糖容易造成碳水化合物 阻遏的問題，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的難題。
[0005] 此外，纖維素酶產(chǎn)生真菌產(chǎn)生的纖維素酶實(shí)質(zhì)為多種酶的混合物，其包含多種纖 維素酶和半纖維素酶，如纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露 聚糖酶，還可以包括木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。不同的培養(yǎng)和/誘導(dǎo)底物，培養(yǎng)發(fā)酵纖 維素酶真菌產(chǎn)生的纖維素酶活性和/纖維素酶混合物的活性（如對(duì)木質(zhì)纖維素底物的降解 活性）往往不同，如何利用一種纖維素酶產(chǎn)生真菌生產(chǎn)高效的纖維素酶混合物，也屬于纖 維素酶生產(chǎn)領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明通過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基（產(chǎn)酶培養(yǎng) 基和補(bǔ)料培養(yǎng)基）和液體補(bǔ)料工藝進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，采用價(jià)格低廉固體的培養(yǎng)基，通過構(gòu)建 培養(yǎng)基中還原糖含量與補(bǔ)料基質(zhì)之間的關(guān)系，不僅解決了以葡萄糖補(bǔ)料造成的CCR效應(yīng)， 而且提高了纖維素酶生產(chǎn)能力，并且提高了生產(chǎn)的纖維素酶活性（如對(duì)木質(zhì)纖維素底物的 降解活性）。
[0007]具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明公開了一種高效纖維素酶混合物的生產(chǎn)方法，所述方法包括：以里氏木霉 或草酸青霉為纖維素酶生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵期間pH始終維持在3. 5-6. 5之間，發(fā)酵 至48-60h，開始補(bǔ)料，補(bǔ)料后還原糖含量< 2. 5mg/mL，每4-5h為一補(bǔ)料速率調(diào)整階段，至結(jié) 束發(fā)酵；
[0009] 補(bǔ)料的培養(yǎng)基為：葡萄糖母液或木糖母液與硫酸鎂、硫酸鋅的混合液；
[0010] 其中葡萄糖母液中，其成分包括：45~60%葡萄糖，15~30%的二糖及5~10% 的多糖，其余為水；木糖母液中，其成分包括：45~70%木糖，5~20%葡萄糖，5~15%阿 拉伯糖，其余為水；
[0011] 所述補(bǔ)料培養(yǎng)基中還原糖濃度為20 %~40%，硫酸鎂濃度為0. 5~1 %，硫酸鋅濃 度為0. 003~0. 008% (上述百分比為質(zhì)量體積百分比）。
[0012] 上述二糖優(yōu)選為麥芽糖。
[0013] 對(duì)于上述方法的獲得，發(fā)明人通過對(duì)發(fā)酵工藝的調(diào)整和優(yōu)化，尤其是對(duì)補(bǔ)料培養(yǎng) 基成分及配比的摸索，發(fā)現(xiàn)不同的發(fā)酵工藝其獲得的纖維素酶生產(chǎn)能力和纖維素酶配比有 極大不同，而且補(bǔ)料培養(yǎng)基中碳源的不同，會(huì)影響酶活（FPA濾紙酶活）和所制備的纖維素 酶混合物的整體催化效率。經(jīng)試驗(yàn)，上述工藝條件較其他條件可以有效的提高纖維素酶生 產(chǎn)能力，并且提高生產(chǎn)的纖維素酶活性。
[0014] 優(yōu)選的，補(bǔ)料后，1. 5mg/mL<還原糖含量< 2. 5mg/mL。
[0015]其中，補(bǔ)料后溶氧降低，通過改變發(fā)酵攪拌槳葉或攪拌速度來彌補(bǔ)溶氧的降低； 優(yōu)選的，補(bǔ)料過程通過控制攪拌或更換攪拌槳葉保持溶氧多10 %，更為優(yōu)選的，保持溶氧 彡 15%〇
[0016] 優(yōu)選的，發(fā)酵開始pH調(diào)整為5. 5-6.0,0-20hpH逐漸下降，用氨水控制發(fā)酵培養(yǎng)基 pH3. 5以上，60h后pH回升至5. 5-6. 0后，開始用磷酸調(diào)節(jié)pH至6. 0以下。
[0017] 本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為非可溶碳源一一玉米芯、玉米秸桿、小麥秸桿、木糖 渣、脫木素渣等，作為菌株發(fā)酵的主要碳源，具體培養(yǎng)基配方如下：
[0018] 2~7%固體非可溶性碳源（比如秸桿、玉米芯、木糖渣），1~4%麩皮，0.2~ 1%微晶纖維素，0.5~1.5%豆餅粉，0. 1~0.4%硫酸銨，0. 1%尿素，0.3%磷酸二氫鉀， 0.05%硫酸鎂，0.3%吐溫80，121°(：滅菌301^11。
[0019] 本發(fā)明還涉及上述生產(chǎn)方法得到的纖維素酶混合物。
[0020] 此外，本發(fā)明進(jìn)一步公開了上述生產(chǎn)方法得到的纖維素酶混合物用于水解纖維素 底物的用途。
[0021] 優(yōu)選的，所述纖維素底物可為一種預(yù)處理的木質(zhì)纖維素底物，如預(yù)處理的秸桿等。
[0022] 本發(fā)明還提供一種水解纖維素底物的方法，包括：將上述生產(chǎn)方法得到的纖維素 酶混合物加至纖維素底物以形成反應(yīng)混合物，其中纖維素酶混合物以每克底物5-10U的濃 度添加。
[0023] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0024] (1)通過非可溶性碳源進(jìn)行發(fā)酵，非可溶性碳源以廉價(jià)的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物玉米芯、麩皮 等作為碳源和營(yíng)養(yǎng)元，價(jià)格低廉，節(jié)約了纖維素酶發(fā)酵成本；此外，非可溶性碳源的使用，并 未降低纖維素酶的生產(chǎn)性能，而且由于不同的碳源使用可誘導(dǎo)出不同活力的纖維素酶，本 發(fā)明通過對(duì)相應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的組成和配比優(yōu)化，可以有效地誘導(dǎo)生產(chǎn)纖維素酶。
[0025] (2)采用還原糖控制措施，不僅有效地降低了纖維素酶生產(chǎn)時(shí)的碳水化合物的阻 遏效應(yīng)，而且通過利用纖維素酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的纖維素酶系、半纖維素酶系將培養(yǎng)基中 的固體基質(zhì)（非可溶性碳源-玉米芯、秸桿、木塘渣等）降解成葡萄糖而提供營(yíng)養(yǎng)，解決液 體深層發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)的快速需求和固體基質(zhì)降解速率慢的矛盾，同時(shí)克服了補(bǔ)加葡萄糖容 易造成碳水化合物阻遏等問題，提高了纖維素酶生產(chǎn)能力。
[0026] (3)本發(fā)明通過葡萄糖母液和木糖母液補(bǔ)料作為補(bǔ)料原料，不僅有效的解除了葡 萄糖造成的碳阻遏效應(yīng)，而且補(bǔ)料培養(yǎng)基可以有效的誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生，這極大提高了 纖維素酶生產(chǎn)能力，發(fā)酵時(shí)的FPA(濾紙酶活）可達(dá)到18. 6U/ml，較常規(guī)生產(chǎn)提高1倍。
[0027] (4)通過本發(fā)明所述工藝，在提升纖維素酶產(chǎn)量（生產(chǎn)能力）的同時(shí)，還優(yōu)化了所 生產(chǎn)的纖維素酶混合物各組分的配比，最終表現(xiàn)為纖維素酶活性的提高，通過優(yōu)化工藝，纖 維素酶活力提尚50%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 測(cè)定方法
[0029] 濾紙酶（FPA)酶活測(cè)定方法：發(fā)酵液8000rpm離心lOmin，取上清為粗酶液，用于 酶活力及蛋白含量測(cè)定。參照輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（QB2583-2003)進(jìn)行測(cè)定，取適當(dāng)稀釋的粗 酶液0. 5mL，以50mg(lcmX6Cm)新華濾紙條為底物，加入pH4. 8醋酸緩沖液1. 5mL和0. 5mL， 以不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)60min，取出，加入3mlDNS溶液，沸水浴中保持lOmin，水浴冷 卻，定容至25ml，混勾，在540nm處比色。
[0030] 還原糖測(cè)定方法：采用DNS法測(cè)定還原糖含量。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 種子培養(yǎng)基：1%木糖渣，1%麩皮，1%葡萄糖，1%蛋白胨，0. 2%硫酸銨，0. 3%磷 酸二氫鉀，〇.〇5%硫酸鎂，5〇1111^于50〇1]11^三角瓶中，121°(^滅菌2〇111；[11。
[0033] 產(chǎn)酶培養(yǎng)基：3%木糖渣，3%麩皮，0. 2%微晶纖維素，0. 5%豆餅粉，0. 2%硫酸銨， 0.1%尿素，0.3%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂，0.3%吐溫80，121°(：滅菌301^11。
[0034] 補(bǔ)料培養(yǎng)基：30%木糖母液，0· 5% (w/v)硫酸鎂，0· 005% (w/v)硫酸鋅，木糖母液 其成分包括50%(w/v)木糖，10%(w/v)葡萄糖，10%(w/v)阿拉伯糖，其余為水。
[0035] 將草酸青霉JUA10-1 (山東大學(xué)贈(zèng)送）劃線接種于麩皮培養(yǎng)基中28~32°C培養(yǎng)7 天，待長(zhǎng)出粉紅色的孢子后轉(zhuǎn)接至新鮮麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)5天作為菌種。接lcm2菌種接種于 種子培養(yǎng)基中，28~32°C200rpm發(fā)酵24~48h，制備成一級(jí)種子，按照5%~10%的接種 量接種一級(jí)種子于種子培養(yǎng)基中，28~32°C200rpm培養(yǎng)30~42h制成二級(jí)種子，然后將 二級(jí)種子接種于4L產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，發(fā)酵開始p