一種普通生酮基古龍酸菌的誘變篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其屬于誘變育種技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉 及到維生素C生產(chǎn)菌株普通生酮基古龍酸菌的誘變篩選方法。本發(fā)明還提供了一種普通生 酮基古龍酸菌篩選用的特制培養(yǎng)基，可以實(shí)現(xiàn)普通生酮基古龍酸菌單菌落平行培養(yǎng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素C是人體必須的一種水溶性維生素，具有抗氧化性、提高機(jī)體免疫力等作 用，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域。
[0003]目前維生素C主要采用二步發(fā)酵法生產(chǎn)工藝，普通生酮基古龍酸菌 (Ketogulonigeniumvulgare)搭配巨大芽孢桿菌等將底物L(fēng)-山梨糖轉(zhuǎn)化為古龍酸（S卩2-酮 基-L-古龍酸），在此過程中，巨大芽孢桿菌等只是伴生菌，輔助普通生酮基古龍酸菌生長和 產(chǎn)酸，后者起到更關(guān)鍵的作用。因此工業(yè)生產(chǎn)中，需要不斷篩選更高效的普通生酮基古龍酸 菌來提高生產(chǎn)效率。
[0004] 菌種選育方法中化學(xué)誘變采用的誘變劑毒性較大，環(huán)境污染高，操作危險(xiǎn)性高。物 理誘變劑X射線、快中子、離子束注入等設(shè)備復(fù)雜，專業(yè)性要求高。近年來，等離子體誘變誘 變育種設(shè)備的開發(fā)，提供了另外一種操作簡單有效的選擇，但各個(gè)菌種特性不同，仍需要對 應(yīng)不同菌種探索調(diào)節(jié)誘變條件。
[0005]普通生酮基古龍酸菌單菌生長能力弱，特別是經(jīng)過誘變處理的菌株，普通的培養(yǎng) 條件很難實(shí)現(xiàn)單菌落生長。中國專利申請（申請?zhí)?201210308418 .X，公開日2013年1月2日） 雖然提供了平板上單菌落生長方法，但仍然需要搭接伴生菌來實(shí)現(xiàn)，而搭接方式是在平板 上間隔點(diǎn)接，培養(yǎng)過程中仍不能實(shí)現(xiàn)普通生酮基古龍酸菌各個(gè)單菌落的平行生長，而且伴 生菌菌落大，會覆蓋誘變菌株，使誘變菌株遺漏，不能全部擴(kuò)大培養(yǎng)，在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，仍 采用搭接伴生菌的方法，此過程操作人員人為因素影響較大，造成伴生菌過大影響了各個(gè) 單菌落的增殖培養(yǎng)，進(jìn)而影響了篩選結(jié)果的穩(wěn)定性。
[0006]為了更高效生產(chǎn)維生素C，從菌種角度而言，需要提高普通生酮基古龍酸菌和伴生 菌的生產(chǎn)效率，尤其要提高普通生酮基古龍酸的生產(chǎn)效率。將等離子體誘變用于普通生酮 基古龍酸菌誘變育種，需要解決采用怎樣的誘變條件，需要解決如何培養(yǎng)誘變普通生酮基 古龍酸菌單菌菌落以及如何以更簡易穩(wěn)定的操作方式篩選出性能優(yōu)良變異菌落的技術(shù)問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種普通生酮基古龍酸菌的單 菌誘變篩選方法，將普通生酮基古龍酸菌進(jìn)行誘變處理后的菌株培養(yǎng)形成單菌落，接著單 菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，然后加入伴生菌，接至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最終篩選出目的菌株。
[0008]該方法以維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的普通生酮基古龍酸菌為出發(fā)菌株，采用低溫常壓 等離子體誘變設(shè)備誘變處理后，涂布至固體培養(yǎng)基均勻生長出單菌落，繼續(xù)單菌增殖擴(kuò)大 培養(yǎng)，搭配伴生菌搖瓶篩選目的菌株。通過以上技術(shù)，提高了普通生酮基古龍酸菌誘變篩選 的平行性，增加獲得高效菌株的幾率。
[0009]第一個(gè)方面，本發(fā)明將等離子體誘變誘變育種應(yīng)用于普通生酮基古龍酸菌誘變育 種。
[0010]適合于普通生酮基古龍酸菌誘變育種的等離子體處理參數(shù)為:處理溫度20°C~35 °C，氦氣流量為5L/min~15L/min，射頻電源輸入功率100W，處理時(shí)間20s~120s。
[0011] 本發(fā)明將等離子體誘變應(yīng)用于普通生酮基古龍酸菌誘變育種，采用的是常壓等離 子體。采用氦氣為工作氣體，則等離子源中含有多種化學(xué)活性離子成分，能夠產(chǎn)生更豐富的 變異。
[0012] 處理溫度20°C~35°C。優(yōu)選采用較低溫度，例如20°C。
[0013] 氦氣流量為5L/min~15L/min。優(yōu)選采用10L/min。
[0014] 處理時(shí)間20s~120s。優(yōu)選采用100s。
[0015]這種誘變育種具有成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，造成的變異多樣性更大，而且對環(huán)境 沒有污染，不危害操作人員的人身安全。
[0016]這種誘變育種方式獲得的是非轉(zhuǎn)基因變異菌株。
[0017]第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種誘變普通生酮基古龍酸菌的誘變方法，包括：1.將 出發(fā)菌株普通生酮基古龍酸菌制成l〇5cfu/ml~106cfu/ml的菌懸液;2.取10μ1~20μ1至載 片上接受等離子體處理，處理溫度20°C~35°C，氦氣流量為5L/min~15L/min，射頻電源輸 入功率100W，處理時(shí)間20s~120s;3.誘變后載片置于lml生理鹽水中，震蕩形成菌懸液。
[0018] 第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選普通生酮基古龍酸菌的篩選培養(yǎng)基，該篩選 培養(yǎng)基包含伴生菌菌體。
[0019]本發(fā)明提供的普通生酮基古龍酸菌篩選培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中含有伴 生菌菌體。
[0020] 優(yōu)選地，普通生酮基古龍酸菌固體篩選培養(yǎng)基為平板培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中含有伴 生菌菌體。
[0021] 伴生菌菌體是通過培養(yǎng)伴生菌、將菌液濃縮干燥制得的伴生菌菌體干粉。將伴生 菌菌體干粉作為篩選培養(yǎng)基一個(gè)成分使用，是本發(fā)明的一個(gè)創(chuàng)新之處。
[0022] 由于普通生酮基古龍酸菌難以生長，需要搭配伴生菌才能生長。在中國專利申請 201210308418.X提供的平板上單菌落生長方法中，需要搭接伴生菌，搭接方式是在平板上 間隔點(diǎn)接。
[0023]本發(fā)明的固體篩選培養(yǎng)基將伴生菌菌體作為一種培養(yǎng)基成分添加進(jìn)培養(yǎng)基中，可 以使固體篩選培養(yǎng)基表面提供一個(gè)均等的生長環(huán)境，使普通生酮基古龍酸單菌落在相同的 微環(huán)境中平行生長，是一種高效篩選培養(yǎng)基。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的組成配方(mg/ml)為:L-山梨糖2~100 mg/ml，酵母浸粉1~30mg/ml，硫酸鎂0.1~10mg/ml，活性干酵母10~200mg/ml，伴生菌 菌體0·1~200mg/ml，蛋白胨5~50mg/ml，瓊脂10~30mg/ml。即每一成分在篩選培養(yǎng)基 中的濃度單位為mg/ml。
[0025]這里的"伴生菌菌體0.1~200mg/ml"表示伴生菌菌體稱重的計(jì)量單位，為折干計(jì) 算，單位為mg，配入培養(yǎng)基單位為mg/ml。
[0026]這種培養(yǎng)基可以制成平板培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基等。
[0027]由于將伴生菌菌體分散到培養(yǎng)基中，當(dāng)誘變后的普通生酮基古龍酸菌菌液被稀釋 到適當(dāng)濃度涂板培養(yǎng)時(shí)，就會使普通生酮基古龍酸菌單菌落平行生長。
[0028]本發(fā)明的篩選培養(yǎng)基克服了中國專利申請201210308418.X中的伴生菌對普通生 酮基古龍酸菌單菌落生長的不均等影響。
[0029]在本發(fā)明的篩選培養(yǎng)基中，可以使用的伴生菌菌體為巨大芽孢桿菌或蠟狀芽孢桿 菌，也可以是其他適合于和普通生酮基古龍酸菌共同發(fā)酵生產(chǎn)古龍酸的菌種。本發(fā)明對伴 生菌的種類不加限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些伴生菌，并能夠?qū)⑵溆迷诒景l(fā)明的培養(yǎng)基 中。
[0030]第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選普通生酮基古龍酸菌誘變菌株的篩選方法， 包括：1.制備固體篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方(mg/ml): L-山梨糖2~100，酵母浸粉1~30，硫 酸鎂0.1~10,活性干酵母10~200,伴生菌菌體0.1~200,蛋白胨5~50,瓊脂10~30;2.將 誘變的菌懸液涂布至固體培養(yǎng)基上；3.培養(yǎng)溫度25°C~35°C，培養(yǎng)48h~120h，形成誘變菌 株單菌落，從中篩選符合要求的變異株。
[0031]第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了 一種普通生酮基古龍酸單菌擴(kuò)大培養(yǎng)方法，包括：1.制 備擴(kuò)大培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方(mg/ml) :L-山梨糖2~100,酵母浸粉1~30,硫酸鎂0.1~10,活 性干酵母10~200，蛋白胨5~50，瓊脂0~30; 2.將固體培養(yǎng)基上的單菌落，接入增殖培養(yǎng)基 擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C~35°C，培養(yǎng)48h~120h。
[0032]第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種古龍酸發(fā)酵制備方法，包括：1.將擴(kuò)大培養(yǎng)完成的 普通生酮基古龍酸單菌，按3~20:1的數(shù)量比例加入伴生菌，形成混合菌;2.接種混合菌至 發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后檢測發(fā)酵液中古龍酸的含量及殘余山梨糖的濃度。
[0033]普通生酮基古龍酸菌單菌與伴生菌數(shù)量比例3~20:1采用單菌計(jì)數(shù)。
[0034]可以采用通用的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法獲得菌液中單菌濃度，通過濃度計(jì)算，獲得上述比 例的混合菌液。
[0035]第七個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種古龍酸發(fā)酵用的混合菌種的篩選方法，包括：1.將 擴(kuò)大培養(yǎng)完成的普通生酮基古龍酸單菌，按3~20:1的數(shù)量比例加入伴生菌，形成混合菌； 2.接種混合菌至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后檢測發(fā)酵液中古龍酸的含量及殘余山梨糖的濃度。
[0036]普通生酮基古龍酸菌單菌與伴生菌數(shù)量比例3~20:1采用單菌計(jì)數(shù)。
[0037]可以采用通用的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法獲得菌液中單菌濃度，通過濃度計(jì)算，獲得上述比 例的混合菌液。
[0038]通過上述這些方面的諸多成果，本發(fā)明提供了一種普通生酮基古龍酸菌的單菌誘 變篩選方法。
[0039]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，其特征在于： 工藝技術(shù)步驟如下： 1普通生酮基古龍酸菌株誘變過程： 將出發(fā)菌株普通生酮基古龍酸菌制成l〇5cfu/ml~106cfu/ml的菌懸液，取?ομL~20μ1 至載片上，處