黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的Indel標記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黃瓜柵欄狀表皮細胞基因 Pe的Indel標記及其在黃瓜育種材料選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜栽培廣泛，歷史悠久，類型和品種十分豐富，根據(jù)果實用途，可將黃瓜分為鮮 食黃瓜和加工黃瓜。加工黃瓜對原材料果實有特殊的要求，一般要求瓜條順直，皮色均勻， 肉質(zhì)較厚，皮質(zhì)緊密。黃瓜果實表皮細胞指黃瓜果實最外層的一層細胞，表皮細胞能減少果 實水分散失，保護果實免受物理傷害，位于表皮上的氣孔能調(diào)節(jié)果實與外界氣體的交換。不 同結(jié)構(gòu)形狀的表皮細胞對于果實所起的作用存在差異，柵欄狀的表皮細胞結(jié)構(gòu)能更好的保 護果實免受物理傷害，減少水分散失，同時使果實皮質(zhì)緊密，更適合于加工；扁平狀的表皮 細胞結(jié)構(gòu)在保護果實免受物理傷害、減少水分散失以及使皮質(zhì)緊密方面的效果相對較差。 [0003]目前，在黃瓜上與果實相關(guān)的性狀（比如，瓜長、把長、刺瘤、棱、紋等）研究較多， 而對于黃瓜果實表皮細胞結(jié)構(gòu)的研究極少，僅見一篇報道。1987年，國外學(xué)者Fanourakis 以具有柵欄狀表皮細胞結(jié)構(gòu)的加工型黃瓜和具有扁平狀表皮細胞結(jié)構(gòu)的鮮食性黃瓜為材 料，進行了果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的遺傳分析，結(jié)果表明，雜交后代h的果實表皮細 胞呈柵欄狀排列，匕群體出現(xiàn)了柵欄狀結(jié)構(gòu)和扁平狀結(jié)構(gòu)的分離，分離比符合柵欄狀：扁平 狀=3:1。結(jié)論認為，黃瓜果實柵欄狀表皮細胞結(jié)構(gòu)是由一個單基因（Pe)控制的，其中柵 欄狀對扁平狀為顯性，且該基因與果色一致基因u、果瘤基因Tu、無光澤基因D有連鎖關(guān)系。 截止目前，尚未見與Pe基因連鎖的分子標記的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于本領(lǐng)域的上述空白，本發(fā)明的目的在于提供了一種與黃瓜果實柵欄狀表皮細 胞基因Pe緊密連鎖的Indel標記，并提供了該標記在篩選果實具有柵欄狀結(jié)構(gòu)表皮細胞的 加工黃瓜種質(zhì)資源上的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe緊密連鎖的Indel標記Indelpe02的引 物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：
[0007] Indelpe02-F/Indelpe02-R：
[0008] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG
[0009] 所述引物擴增的與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的特征條帶為125bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；
[0010] 所述引物擴增的與黃瓜果實扁平狀表皮細胞基因pe連鎖的特征條帶為130bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 2所示。
[0011] 用于篩選包含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的試劑盒，其特征在于，包 括所述的Indel標記Indelpe02的引物。
[0012] 所述試劑盒還包括進行PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試劑。
[0013]用于篩選具有果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的方法，其特征在于，采用 所述的Indel標記Indelpe02的引物和/或所述的試劑盒進行如下步驟：
[0014] (1)采用所述Indel標記Indelpe02的引物對待選黃瓜材料的基因組DNA進行PCR 擴增；
[0015] (2)對擴增結(jié)果進行凝膠電泳檢測；
[0016] (3)從檢測結(jié)果中篩選出現(xiàn)與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的Indel標記 特征條帶一致的材料，所述與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的Indel標記特征條帶 為125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示。
[0017] 所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：1. 5ng/μ1DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ μ1，0.5μ1/μ1Go丨叫笈GreenMasterMix，其余為雙蒸水。
[0018] 所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒， 72°C延伸30秒，35個循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
[0019] 所述凝膠電泳檢測指，采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分 離，最后銀染顯色。
[0020] 所述試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝試劑盒的試劑中包括所述的Indel標 記Indelpe02的引物，或
[0021] 在標有篩選含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有所述 的Indel標記Indelpe02的引物。
[0022] 組裝試劑盒的試劑中還包括PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試劑，或
[0023] 在標有篩選含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有PCR 反應(yīng)和/或電泳所需的試劑。
[0024] 本發(fā)明提供一種與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe緊密連鎖的Indel標記 Indelpe02的引物，該引物的核苷酸序列如下：Indelpe02-F/Indelpe02_R:
[0025] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG;所述引物擴增的與黃瓜果實柵 欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的特征條帶為125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；所述 引物擴增的與黃瓜果實扁平狀表皮細胞基因pe連鎖的特征條帶為130bp，其核苷酸序列如 SeqIDNo. 2所示。采用本發(fā)明所述的Indel標記Indelpe02的引物對黃瓜材料進行PCR 擴增檢測，能較為準確地測定待測材料中是否含有黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe，可被 有效地應(yīng)用于含有Pe基因的黃瓜材料的分子標記輔助選擇育種，從而省去了傳統(tǒng)的依靠 顯微鏡觀察細胞結(jié)構(gòu)的辨別步驟，大大地節(jié)省了獲得含有基因Pe的目標材料的篩選時間， 提高了育種效率。
[0026] 基于上述Indel標記Indelpe02的引物，本發(fā)明的一些實施例還提供了用于篩選 包含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求所述的 Indel標記Indelpe02的引物。進一步地，所述試劑盒還包括進行PCR反應(yīng)和/或電泳所需 的試劑。采用試劑盒的形式能進一步完善本發(fā)明產(chǎn)品維度，提高本發(fā)明產(chǎn)品的便攜度，有利 于所述Indel標記Indelpe02的引物的推廣應(yīng)用。
[0027] 在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明還提供了用于篩選具有果實柵欄狀表皮細胞基 因Pe的黃瓜材料的方法，所述方法指，采用所述的Indel標記Indelpe02的引物和/或所 述的試劑盒進行如下步驟：（1)采用所述Indel標記Indelpe02的引物對待選黃瓜材料的 基因組DNA進行PCR擴增；（2)對擴增結(jié)果進行凝膠電泳檢測；（3)從檢測結(jié)果中篩選出現(xiàn) 與黃瓜果實柵欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的Indel標記特征條帶一致的材料，所述與黃瓜果 實柵欄狀表皮細胞基因Pe連鎖的Indel標記特征條帶為125bp，其核苷酸序列如SeqID No. 1所示。采用本發(fā)明所述的Indel標記Indelpe02的引物和/或所述的試劑盒，通過上 述的步驟，能夠較為快速、便捷、準確地獲知待測黃瓜材料中是否含有果實柵欄狀表皮細胞 基因Pe，而無需再對黃瓜材料的細胞結(jié)構(gòu)進行觀察，為育種工作節(jié)省了時間，提高了效率。
[0028] 具體地，所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：1.5ng/ylDNA模板，所述引物正向和反向 各 5ng/μ1，0· 5μ1/μ1GoTaqS".GreenMasterMix，其余為雙蒸水。所述PCR擴增的反 應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個循環(huán)； 72°C保溫5分鐘，16°C保存。所述凝膠電泳檢測指，采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于 150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。上述試驗參數(shù)是本發(fā)明根據(jù)引物的實際情況摸索調(diào) 試得出，在上述反應(yīng)條件下能夠使檢測結(jié)果以最優(yōu)的形式呈現(xiàn)，從而進一步地提高本發(fā)明 選擇含有果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的準確性。
[0029] 在本發(fā)明進一步地實施例中，本發(fā)明還請求保護所述的試劑盒的制備方法，任 何基于商業(yè)目的的生產(chǎn)、制造和/或銷售所述試劑盒的行為均屬于本發(fā)明請求保護的范 圍。所述行為指，組裝試劑盒的試劑中包括所述的Indel標記Indelpe02的引物，或在標 有篩選含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有所述的Indel標記 Indelpe02的引物。進一步地，組裝試劑盒的試劑中還包括PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試 劑，或在標有篩選含果實柵欄狀表皮細胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有PCR反應(yīng) 和/或電泳所需的試劑。
[0030] 本發(fā)明以果實具有扁平狀結(jié)構(gòu)表皮細胞的黃瓜高代自交系WI2757與果實具有柵 欄狀結(jié)構(gòu)表皮細胞的黃瓜高代自交系Wis.SMR18為親本構(gòu)建FpF2、BCVVΒ(^Ρ2群體，在盛 瓜期采摘商品瓜，制作果實橫切面切片，在顯微鏡下觀察商品瓜表皮細胞結(jié)構(gòu)，進行遺傳分 析。以？ 2群體為作圖材料，利用BSA法和SSR及Indel標記技術(shù)，實現(xiàn)Pe基因在染色體上的 遺傳定位，并獲得緊密連鎖的Indel標記Indelpe02,與Pe的遺傳距離為3. 9cM。