基于InDel標記的常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物鑒別技術領域，涉及一種基于InDel標記的常規(guī)稻品種淮稻5號 和淮稻18號的鑒定方法，即一種利用水稻DNA插入或缺失分子標記鑒定常規(guī)稻品種淮稻5 號和淮稻18號的方法。
【背景技術】
[0002] 栽培稻（OryzasativaL.)是世界上最重要的糧食作物之一，具有豐富的遺傳多 樣性。水稻品種鑒定對于水稻遺傳研究和品種培育具有重要意義。已經(jīng)報道的鑒定水稻品 種的方法多為粳稻和秈稻亞種的鑒定，如以形態(tài)鑒定為基礎的"程氏指數(shù)法"（包括六個性 狀：稃毛、酚反應、穗節(jié)長、稻殼色、葉毛和谷粒長寬比）和基于分子標記的粳稻-秈稻鑒定 方法等。對某一具體品種是否為特定的水稻品種進行鑒定的方法則限于SNP芯片的一種方 法，但SNP芯片價格昂貴，分析周期較長，后續(xù)的數(shù)據(jù)處理繁瑣，不能當天得到檢測結(jié)果。
[0003] 淮稻5號系江蘇省徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)科所選育而成，是一個集高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)于一 體的遲熟中粳稻新品種。2000年通過江蘇省審定，審定編號為蘇種審字第358號。該品種 株型較緊湊，莖桿粗壯抗倒。葉片挺立。分蘗性中上等，最高莖蘗數(shù)28萬/畝。莖蘗生長整 齊，成穗率高達80%以上。穗粒協(xié)調(diào)，一般每畝成穗數(shù)22萬，每穗總粒數(shù)為110 - 130粒， 結(jié)實率90%以上，千粒重28克左右。對白葉枯病、稻瘟病、紋枯病均表現(xiàn)良好的抗性，稻曲 病輕。全生育期150天左右，與武育粳3號相仿。后期轉(zhuǎn)色好，熟色熟相倶佳，較難脫粒。米 質(zhì)優(yōu)良，米飯潔白有光澤，口感好。適合我省淮南地區(qū)中上等肥力條件下種植。
[0004] 淮稻18號由江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所和淮陰師范學院以淮66/徐23121 雜交，于2010年育成，屬遲熟中粳稻品種。適宜江蘇省蘇中地區(qū)及寧鎮(zhèn)揚丘陵地區(qū)種植。該 品種株型緊湊，長勢較旺，穗型中等，分蘗力較強，葉色中綠，后期灌漿快，熟色好，抗倒性較 強；省區(qū)試平均結(jié)果：每畝有效穗22. 4萬，每穗實粒數(shù)114. 1粒，結(jié)實率93. 8%，千粒重28. 3 克，株高96. 0厘米，全生育期154. 6天，比對照淮稻9號遲熟2天。病害鑒定：穗頸瘟損失 率3級、穗頸瘟綜合抗性指數(shù)4. 25,中感白葉枯病，抗紋枯病、條紋葉枯病，米質(zhì)理化指標經(jīng) 農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量檢測中心2014年檢測：整精米率73. 7%，堊白率11%，堊白度3. 2%，膠稠度 69毫米，直鏈淀粉含量18. 2%，達到國標三級優(yōu)質(zhì)稻谷標準。
[0005] 淮稻5號和淮稻18遺傳背景相似，可能在生產(chǎn)中產(chǎn)生品種混淆，用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定 方法時間周期長，出錯機率高，有必要建立基于基因型的快速鑒定方法。
[0006]InDel標記（insertion-deletionlengthpolymorphism)，也叫插入缺失長度多 態(tài)性，是由于堿基序列的相對插入或者缺失造成的，在基因組中分布廣泛，長度從一個核苷 酸到幾百甚至幾萬不等。對InDel標記臨側(cè)保守的序列設計成對引物，通過PCR技術，經(jīng)聚 丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示InDel位點在不同個體間的多態(tài)性，從而達到鑒定的目的。與 應用較廣的SSR標記相比，InDel標記具有以下優(yōu)點：（1)數(shù)量十分豐富，廣泛分布于各條 染色體上；（2)是共顯性標記，符合孟德爾遺傳規(guī)律；（3)設計簡單，易于操作，技術重復性 好，結(jié)果可靠。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對傳統(tǒng)形態(tài)觀察難區(qū)分品種差異的技術缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于 InDel標記的常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號的鑒定方法，通過開發(fā)的24對特異性引物用 以鑒定常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號，旨在快速鑒定某特定品種是否為新培育的優(yōu)質(zhì)常 規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號，對待鑒定品種進行基因組DNA的提取，使用本研究報道的 特定引物對組合對其進行PCR，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色，當天即可得到品 種的鑒定結(jié)果，高效、準確、可靠。
[0008] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：利用粳稻品種日本晴與秈稻品種93-11的全 基因組DNA序列的比對而獲得插入/缺失差異片段所設計的24對特異DNA引物，對淮稻5 號和淮稻18號進行DNA提取、DNA片段擴增和電泳分離以及電泳圖譜的分析來鑒定淮稻5 號和淮稻18號品種；具體而言，利用24對InDel引物組合，對基于聚合酶鏈式反應和凝膠 垂直板電泳獲得的指紋圖譜進行分析，根據(jù)24個InDel位點的電泳帶型，進而確定是否是 常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號；其特征是：基于InDel標記的常規(guī)稻品種淮稻5號和淮 稻18號的鑒定用InDel特異引物對對應如下列表所述：
上述基于InDel標記的常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號的鑒定方法包括步驟如下： 步驟一、選取水稻植株的任何器官或組織提取總DNA ; 步驟二、用引物對擴增步驟一所述DNA ; 步驟三、對步驟二所述擴增的產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，24個位點的結(jié)果完全一致，則為 常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號。
[0009] 其中，步驟一中，所述提取總DNA具體是指用CTAB法提取核基因組DNA。
[0010] 其中，步驟二中，所述擴增體系：20yL，包括30-50ng的模板的DNA，0. 25個單位的 DNA聚合酶（申能博彩），2.0yL的lOXBuffer(含Mg2+)，2.0mMdNTPs2yL; 所述擴增程序：94°C預變性5min;94°C變性30s，58°C復性30s，72°C延伸30s，32個循 環(huán)；最后72°C延伸7min。 toon] 其中，步驟三中，凝膠電泳分析具體為：加入適量上樣緩沖液于步驟二所述擴增的 產(chǎn)物中，在22V/cM恒定電場強度下，經(jīng)12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳100分鐘后，銀染顯 色；含有水稻DNA的樣品在前述24對引物組合時，能分別在不同位點（引物對）上擴增出現(xiàn) 明顯的多態(tài)性帶型（下面的兩條主帶和上面的重組帶)。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果： 1、 利用水稻全基因組特異位點上的InDel片段差異設計的特異引物，秈-粳雜合帶型 來鑒定常規(guī)稻淮稻5號和淮稻18號，方法簡便，樣品用量少，準確性高，速度快； 2、 基于PCR擴增反應，利用秈-粳稻24個位點上的InDel片段序列差異和PCR反應的 快速高效性，在短時間內(nèi)能精確鑒定常規(guī)稻品種淮稻5號和淮稻18號，方法簡便、快捷，有 很好的應用推廣前景； 3、 對InDel標記旁鄰保守的序列設計成對引物，通過PCR技術，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電 泳，即可顯示InDel位點在不同個體間的多態(tài)性，從而達到鑒定的目的； 4、 使用的聚合酶鏈式擴增體系為常規(guī)PCR體系，不需要特殊的PCR儀和特殊的反應試 劑，任何公司生產(chǎn)的PCR儀和任何生物試劑公司生產(chǎn)的試劑均可使用而達到目的。
【附圖說明】
[0013] 通過閱讀參照附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的 和優(yōu)點將會變得更明顯： 圖1為PCR電泳圖，泳道1至泳道7分別為水稻品種9311、II優(yōu)084、淮稻18號、粵泰A、粵優(yōu)938、淮稻5號、日本晴；從圖1可以看出，淮稻18號基因型主要為粳稻背景（日本 晴)，與