0mL的 96%~100%酒精；熒光定量PCR反應(yīng)液 為100個(gè)反應(yīng)的SYBRGreenPrimixExTaqII試劑、終濃度為25pmol/uL的中型艾美耳 球蟲(chóng)特異性引物。
[0032] 一、上述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0033] ⑴糞便DNA的提?。?br>[0034] 參照QIAampDNAStoolMiniKit的使用說(shuō)明，具體操作步驟如下：
[0035]a.稱(chēng)取200mg糞便放置在2mL的離心管。
[0036]b.加入1. 4mLASLBuffer和 0·4g玻璃珠（1mm)，震蕩 1~2h。
[0037]c.將懸浮液放置70°C，5minD
[0038] d.游禍震蕩15s，然后離心樣品15000rpm，lmin。
[0039]c.吸取1. 2mL懸浮液到2mL離心管中。
[0040]e.加入1個(gè)InhibitExTablet到離心管中，立即游渦震蕩lmin，直到InhibitEx Tablet完全懸浮，室溫下靜置lmin。
[0041] f.離心樣品 15000rpm，3min。
[0042]g.吸取所有上清液到新的1. 5mL離心管中，離心樣品15000rpm，3min。
[0043]h.吸取 15μLproteinaseK到新的 1. 5mL離心管中。
[0044]i.吸取步驟g中的200μL上清液到乘有proteinaseK中的1.5mL離心管中。
[0045]j.加入 200μLBufferAL，游禍震蕩 15s〇
[0046]k.瞬時(shí)離心，70°C水浴 10min。
[0047] 1.加入200μL酒精（96%-100% )，漩渦震蕩混勻，瞬時(shí)離心。
[0048]m.小心地將步驟1中的液體加入到QiAampMiniSpinColumn中，蓋上蓋子，離心 15000rpm，lmin。將QiAampSpinColumn放入一個(gè)新的 2mL的CollectionTube。（注：如 果離心完后，看到QiAampSpinColumn中仍有液體，再離心一次)
[0049]η·小心打開(kāi)QiAampSpinColumn，加入 500μLBufferAW1，蓋上蓋子，離心 15000rpm，lmin。將QiAampSpinColumn放入新的 2mLCollectionTube。
[0050] 〇·小心打開(kāi)蓋子，加入500μLBufferAW2D蓋上蓋子離心15000rpm，3min。
[0051]建議：將QiAampSpinColumn放入一個(gè)新的 2mL的CollectionTube，離心 15000rpm，lmin〇
[0052]p.將QiAampSpinColumn放入一個(gè)新的1. 5mL離心管中，小心打開(kāi)QiAampSpin Column蓋子，加入50μLBufferAE在QiAampSpinColumn膜上蓋上蓋子，在室溫下靜 置lmin，然后離心15000rpm，lmin，離心管里即為DNA。
[0053](2)熒光定量PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件：
[0054]反應(yīng)體系為：SYBRGreenPrimixExTaqII10μL，上下游引物（25pmol/μL)各 0· 25μL，模板DNA2μL，ddΗ20 7· 5μL，共 20μL。
[0055] ?0?擴(kuò)增條件：95°(：預(yù)變性3〇8;95°(：變性58,59°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8(40個(gè)循 環(huán)）。
[0056] (3)熒光定量PCR結(jié)果分析：從終端電腦上讀取熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0057] 二、試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0058] 吸取含106個(gè)卵囊的兔中型艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行DNA提取，提取得到的DNA稱(chēng)為DNA 原液，將DNA原液做1 :10~1 :105倍比稀釋?zhuān)玫降?個(gè)梯度的DNA樣品相當(dāng)于卵囊數(shù)分 別為105、104、10 3、102、101所提取得到的DNA，將這5個(gè)梯度的DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，反應(yīng)體系和條件同上，根據(jù)熒光定量PCR的動(dòng)力學(xué)曲線結(jié)果，檢測(cè)儀系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo) 準(zhǔn)曲線（圖2B)以及回歸方程（表2);本發(fā)明用兔中型艾美耳球蟲(chóng)種特異性引物對(duì)未知模 板DNA進(jìn)行SYBRGreen染料熒光定量PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)"S"擴(kuò)增曲線，陰性結(jié)果則 不會(huì)出現(xiàn)。將得到的CT值代入標(biāo)準(zhǔn)方程即可求得未知樣品的卵囊含量。
[0059] 表2兔中型艾美耳球蟲(chóng)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)方程
[0060]
[0061] 注：x=卵囊量，CT值為熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。
[0062] 實(shí)施例3試劑盒的敏感性試驗(yàn)
[0063] 將兔中型艾美耳球蟲(chóng)106個(gè)卵囊DNA原液做1 :10~1 :10 6倍比稀釋?zhuān)脤?shí)施例2 所建立的real-timePCR方法進(jìn)行檢測(cè)，分析敏感性結(jié)果見(jiàn)圖3,最低能檢測(cè)到10個(gè)卵囊的 DNA〇
[0064] 實(shí)施例4試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0065] 將兔中型艾美耳球蟲(chóng)DNA原液分別做1 :10~1 :105倍比稀釋形成5個(gè)梯度，進(jìn)行 3次組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，用實(shí)施例2所述熒光定量PCR體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根 據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算CT平均值和變異系數(shù)（CV)，評(píng)價(jià)這些方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯 示所建立的幾種方法組內(nèi)組間重復(fù)性變異系數(shù)CV為0. 1 %~1. 8%，均小于2%。說(shuō)明該方 法具有良好的穩(wěn)定性。
[0066] 表3中型艾美耳球蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0067]
[0068] 實(shí)施例5實(shí)施例2所述試劑盒對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
[0069] 采集佛山蘆苞地區(qū)幾個(gè)規(guī)?；耐脠?chǎng)糞便樣品共計(jì)32份，其中種兔12份，幼兔20 份，對(duì)每份樣品分別稱(chēng)取200mg的糞便進(jìn)行糞便DNA提取（QIAGEN糞便DNA提取試劑盒）， 再用實(shí)施例2建立的熒光定量方法檢測(cè)，得到每個(gè)樣品的CT值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出卵囊 含量，再推算出OPG(每克糞便中的卵囊含量）大小，計(jì)算兔中型艾美耳球蟲(chóng)球蟲(chóng)的感染情 況。定量檢測(cè)結(jié)果及顯微鏡計(jì)數(shù)（顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果是11種球蟲(chóng)混合卵囊的量）結(jié)果如表 4 (1~12號(hào)樣品為種兔，13~32號(hào)為幼兔）。
[0070] 表4臨床樣品熒光定量檢測(cè)結(jié)果及鏡檢結(jié)果（0PG)
[0071]
[0072]

[0073] 由上表可以看出，傳統(tǒng)的顯微鏡檢查有一定局限性，不易定種，且只有當(dāng)0PG在 100以上才能被檢測(cè)出，而熒光定量PCR檢測(cè)方法的精確度更高，能檢測(cè)出顯微鏡檢測(cè)為陰 性的樣品。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種針對(duì)兔中型艾美耳球蟲(chóng)病的熒光定量PCR檢測(cè)引物對(duì)，其特征在于，所述引物 對(duì)為Me-F和Me-R，其序列如SEQ ID NO :1~2所示。2. -種檢測(cè)兔中型艾美耳球蟲(chóng)病的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1 所述的檢測(cè)引物對(duì)和熒光定量檢測(cè)試劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中Me-F和Me-R的濃度分 別為 25 pmol/uL。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括DNA提取試劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量檢測(cè)試劑為SYBR Green Primix Ex TaqH，所述 DNA 提取試劑為 QIAamp DNA Stool Mini Kit。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的熒光定量PCR反應(yīng)體系 為：SYBR Green Primix Ex Taq i: 10 μ L，Me-F 和 Me-R 各 0· 25 μ L，模板 DNA 2 μ L，dd H2O 7. 5 μ L，共 20 μ L。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的熒光定量PCR反應(yīng)條件 為：95 °C預(yù)變性30 s;95 °C變性5 s，59 °C退火30 s，72 °C延伸30 s共運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了兔中型艾美耳球蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)引物和試劑盒，所述引物為Me-F和Me-R，其序列如SEQ？ID？NO：1～2所示，基于所述引物優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種基于熒光染料法的定量檢測(cè)兔中型艾美耳球蟲(chóng)熒光定量PCR試劑盒，試劑盒操作簡(jiǎn)單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定客觀。該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)兔球蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查及臨床診斷，為兔球蟲(chóng)的診斷和防治技術(shù)，臨床快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)兔球蟲(chóng)的感染情況提供技術(shù)支持。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105420362
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510927370
【發(fā)明人】林瑞慶, 許家園, 翁亞彪, 胡會(huì)朋, 李國(guó)良, 何茜, 呂夢(mèng)娜
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日