同時檢測三種氣單胞菌的多重pcr引物組及探針和檢測方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領域，尤其涉及同時檢測三種氣單胞菌的多重PCR引物 組及探針和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界上的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，然而，病害損失嚴重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可 持續(xù)發(fā)展。嗜水氣單胞菌（AeromonasHydrophila，簡稱AH)、維氏氣單胞菌（Aeromonas Veronii，簡稱AV)和舒伯特氣單胞菌（AeromonasSchubertii，簡稱AS)是流行于我國的致 病性氣單胞菌，由這三種病原菌引發(fā)的疾病不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，還可 通過水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品感染人畜，導致人畜腹瀉和食物中毒。針對主要致病菌株建立準確 可靠的檢測技術(shù)對于傳染病的防控工作具有重要意義。
[0003] 氣單胞菌的檢測技術(shù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)的分離鑒定法、免疫檢測技術(shù)，到分子生物學 方法的轉(zhuǎn)變。李晨等（2010年）報道了針對鰻弧菌、嗜水氣單胞菌以及遲緩愛德華氏菌多 重PCR檢測方法。劉春等人（2014年）報道了針對鱧源致病性舒伯特氣單胞菌的雙重PCR 檢測方法。由于氣單胞菌屬成員之間基因同源性高，普通PCR檢測方法難以區(qū)別。余波等人 (2014年）報道了一種檢測大鯢致病性嗜水氣單胞菌的SYBRGreenI熒光定量PCR診斷試 劑盒。探針法實時熒光定量PCR技術(shù)引入分子探針，以其高特異和高敏感的特性，對高同源 性菌株的檢測具有明顯優(yōu)勢。目前已有報道應用多重熒光定量PCR技術(shù)檢測氣單胞菌，如 孟雙等人（2012年）報道了檢測嗜水氣單胞菌的三重TaqManPCR快速檢測體系。在同一 個反應管內(nèi)，利用具有多個激光通道的熒光PCR檢測儀，建立一種同時檢測嗜水氣單胞菌、 維氏氣單胞菌和舒伯特氣單胞菌的多重熒光定量PCR反應體系未見報道和相關(guān)文獻公開。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提出一種同時檢測三種氣單胞菌的多重PCR檢測方法，其可在 水生動物和水產(chǎn)品中能快速和同時檢測和辨別嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和舒伯特氣單 胞菌，實現(xiàn)同氣單胞菌屬內(nèi)不同菌種的快速檢測，克服了氣單胞菌屬之間同源性對檢測的 影響。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提出上述檢測方法中使用的引物組及探針，具有靈敏度 高、特異性好等優(yōu)點，能夠及時發(fā)現(xiàn)和確診可疑病例，提高對該類病原的監(jiān)測水平。
[0006] 為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種同時檢測三種氣單胞菌的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0008] (1)從被檢測動物的組織或者微生物培養(yǎng)液中提取DNA;
[0009] (2)以步驟⑴中提取的DNA為模板和三對特異性引物與三條TaqMan探針進行多 重熒光定量PCR檢測；
[0010] (3)根據(jù)檢測后的特異性S擴增曲線和循環(huán)值進行結(jié)果判斷，獲得檢測結(jié)果；
[0011] 其中步驟⑵中的三對特異性引物與三條TaqMan探針如下：
[0012] 嗜水氣單胞菌上游引物AH-F:5' -GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3'（SEQIDNO:1)，或者 為該序列的核酸互補序列；
[0013] 嗜水氣單胞菌下游引物AH-R:5' -GCGATACTTGTCGCCACAGA-3'（SEQIDNO:2)，或 者為該序列的核酸互補序列；
[0014] 嗜水氣單胞菌探針AHP:5'F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3'（SEQIDN0 : 3)，或者為該序列的核酸互補序列；
[0015] 維氏氣單胞菌上游引物AV-F:5' -TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3'（SEQIDNO:4)，或 者為該序列的核酸互補序列；
[0016] 維氏氣單胞菌下游引物AV-R:5' -CCGCCCATTTGACCTGATC-3'（SEQIDNO:5)，或者 為該序列的核酸互補序列；
[0017] 維氏氣單胞菌探針AVP:5'F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3'（SEQIDN0 :6)， 或者為該序列的核酸互補序列；
[0018] 舒伯特氣單胞菌上游引物AS-F:5' -GGCGGTCATTTCGGTCAA-3'（SEQIDNO:7)，或 者為該序列的核酸互補序列；
[0019] 舒伯特氣單胞菌下游引物AS-R:5' -AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3'（SEQIDNO:8)， 或者為該序列的核酸互補序列；
[0020] 舒伯特氣單胞菌探針ASP:5'F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3'（SEQIDNO:9)， 或者為該序列的核酸互補序列；
[0021] 上述探針中F為報告熒光基團，Q為淬滅熒光基團。
[0022] 更進一步的說明，所述的F為FAM、HEX和CY5中的任一種；所述的Q為BHQ系列。
[0023] 更進一步的說明，所述步驟（2)中進行多重熒光定量PCR檢測時，反應體系包括 2XSGprobeMasterMix10yL，AH、AV、AS10以]?上下游引物各取0.5 4 1^八!1、八￥、八5 10μMTaqMan探針各取0. 5μL，樣品DNA模板取1μL，并用雙蒸水補充體積至20μL。
[0024] 更進一步的說明，所述步驟（2)中進行多重熒光定量PCR檢測時，反應參數(shù)為95°C 預變性10min;95°C變性20sec，60°C退火并延伸30sec，40-50個循環(huán)，在每個循環(huán)的60°C 退火并延伸階段收集熒光信號。
[0025] 更進一步的說明，所述步驟（3)的判斷方法為根據(jù)三重熒光定量PCR反應中的特 異性S曲線與對應的閾值大小判斷被檢樣品中是否有嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和舒伯 特氣單胞菌。
[0026] 更進一步的說明，其判斷方法為：對于無S曲線產(chǎn)生且Ct值多40者，判定結(jié)果為 陰性，報告結(jié)果為未檢出；Ct值< 35,判定該樣品結(jié)果為陽性；Ct值在35-40之間，報告結(jié) 果為建議樣本重做；重做Ct值多40者為陰性，反則為陽性。
[0027] 更進一步的說明，所述步驟（1)中DNA的提取利用微生物DNA提取試劑盒從被檢 測動物的組織或者微生物培養(yǎng)液中提取獲得。
[0028] 更優(yōu)的，上述同時檢測三種氣單胞菌的多重PCR引物組及探針，其核苷酸序列分 別如下所示：
[0029] 嗜水氣單胞菌上游引物AH-F:5' -GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3'（SEQIDNO:1);
[0030] 嗜水氣單胞菌下游引物AH-R:5' -GCGATACTTGTCGCCACAGA-3'（SEQIDNO:2);
[0031]嗜水氣單胞菌探針AHP:5'F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3'（SEQIDNO: 3)；
[0032]維氏氣單胞菌上游引物AV-F:5' -TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3'（SEQIDNO:4);
[0033]維氏氣單胞菌下游引物AV-R:5' -CCGCCCATTTGACCTGATC-3'（SEQIDNO:5);
[0034]維氏氣單胞菌探針AVP:5'F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3'（SEQIDNO:6);
[0035]舒伯特氣單胞菌上游引物AS-F:5' -GGCGGTCATTTCGGTCAA-3'（SEQIDNO:7);
[0036]舒伯特氣單胞菌下游引物AS-R:5'-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3'（SEQIDNO:8);
[0037]舒伯特氣單胞菌探針ASP:5'F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3'（SEQIDNO: 9)；
[0038] 上述探針中F為報告熒光基團，Q為淬滅熒光基團。
[0039] 本發(fā)明采用多重TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)，針對致病性嗜水氣單胞菌、維氏氣 單胞菌的Aer基因和舒伯特氣單胞菌的gyrB基因序列分別設計引物和TaqMan探針，分別 使用FAM、HEX等基團作為探針的發(fā)光基團，設計并構(gòu)建標準陽性質(zhì)粒、計算出其拷貝數(shù)，建 立陽性對照樣品標準曲線，優(yōu)化RT-PCR的反應體系，以對應于熒光定量PCR儀的不同波長 段用于同時檢測，構(gòu)建出基于引物和熒光探針的三種氣單胞菌多重熒光定量RT-PCR檢測 方法。本方法具有特異性強、靈敏