致肝膿腫肺炎克雷伯菌特異性基因序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)疾病診斷和治療藥物選擇領(lǐng)域，具體涉及致肝膿腫肺炎克雷伯菌 基因特異性序列及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯菌（K.pneumoniaesubsp.pneumonia)，屬于腸桿菌科細(xì)菌，革蘭染 色陰性，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛，無芽孢和鞭毛，寄生于人體皮膚、鼻咽部和腸道等 處，可引起嚴(yán)重的肺炎、尿路感染和血流感染等，是臨床上常見的條件致病菌（LiB，Zhao Y，LiuC，ChenZ,ZhouD.MolecularpathogenesisofKlebsiellapneumoniae.Future Microbiol，2014 ;9 (9):1071-81)。
[0003] 肝膿腫（LiverAbSCeSS，LA)是發(fā)生于肝臟的一種繼發(fā)性感染性疾病，可以由細(xì) 菌、真菌、寄生蟲等引起，感染病變中心液化壞死、組織溶解、肉芽組織覆蓋并形成膿腔， 是常見的消化系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。20世紀(jì)70年代以前，細(xì)菌性肝膿腫主要由以大腸埃希菌 為主，當(dāng)時(shí)非手術(shù)治療肝膿腫的死亡率高達(dá)83%，手術(shù)治療的死亡率高達(dá)28%，促成高死 亡率的主要原因是途斷和治療的不及時(shí)（VallesJ，C.Leon，Alvarez-Lerma.Nosocomial bacteremiaincriticallyillpatients:amulti-centerstudyevaluating epidemiologyandprognosis.ClinInfectDis，1997, 24:387-395)D1986年，臺(tái)灣Liu等 人首次報(bào)道了由肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的肝膿腫病例7例（LiuY，ChengD，LinC.Klebsiella pneumoniaeliverabscessassociatedwithsepticendophthalmitis.ArchInternMed 1986 ;146:1913 - 16)。隨后肺炎克雷伯菌肝膿腫在東亞地區(qū)開始流行，包括：中國、新加 坡、香港、韓國和越南等。1999年，美國出現(xiàn)肺炎克雷伯菌肝膿腫病例并開始流行（Saccente M.Klebsiellapneumoniaeliverabscess,endophthalmitis，andmeningitisinaman withnewlyrecognizeddiabetesmellitus.ClinInfectDis. 1999 ;29 (6):1570 -L)； 2012年歐洲出現(xiàn)肺炎克雷伯菌肝膿腫病例（MooreR，O'SheaD，GeogheganT，Mallon PW，SheehanG.Community-acquiredKlebsiellapneumoniaeliverabscess:an emerginginfectioninIrelandandEurope.Infection2013 ；41 (3) :681-6.);至今， 肺炎克雷伯菌肝膿腫遍及全球。隨著科技的發(fā)展，超聲或CT定位下經(jīng)皮穿刺引流聯(lián)合高 效廣譜抗生素是治療肺炎克雷伯菌肝膿腫的有效方式，但肺炎克雷伯菌肝膿腫病死率仍達(dá) 4-16%(WangJ,LiuY,LeeS,YenM,ChenY,WangJ,ffannS,LinH.Primaryliverabsce ssduetoKlebsiellapneumoniaeinTaiwan.ClinInfectDis. 1998 ;26:1434 - 8)〇其 主要原因?yàn)榉窝卓死撞文撃[不能及時(shí)診斷，從而耽誤有效治療。
[0004] 臨床上，肺炎克雷伯菌肝膿腫常伴發(fā)其他部位的感染，常見的是血流感染、眼炎 和腦膜炎。除了其伴發(fā)感染的典型癥狀外，肺炎克雷伯菌肝膿腫本身的臨床表現(xiàn)沒有其 特征性，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)和腹痛（ChanK，YuW，TsaiC，ChengK，HouC，LeeM，Tan C.PyogenicliverabscesscausedbyKlebsiellapneumoniae:analysisofthe clinicalcharacteristicsandoutcomesof84patients.ChinMedJ(Engl)2007 ； 120:136 - 39)。其實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的變化（如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例和肝功能指標(biāo) 等）也并非肺炎克雷伯菌肝膿腫所特異（LeeS,ChenY,TsaiH，WannS,LinH,HuangC,Liu Y.Predictorsofsepticmetastaticinfectionandmortalityamongpatientswith Klebsiellapneumonialiverabscess.ClinInfectDis2008;47:642 - 50)。因此，臨床 上往往容易遺漏肺炎克雷伯菌肝膿腫的相關(guān)檢查。肺炎克雷伯菌肝膿腫的診斷存在不少的 困難。臨床上，肺炎克雷伯菌肝膿腫的診斷金標(biāo)準(zhǔn)是超聲或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺抽吸膿 液，膿液中分離培養(yǎng)到肺炎克雷伯菌。但是，膿腔中的細(xì)菌往往因?yàn)榛颊咔捌诳股氐氖褂?以及大量白細(xì)胞的吞噬和裂解，多為死菌，培養(yǎng)陽性率較低。血液中分離培養(yǎng)到肺炎克雷伯 菌，結(jié)合肝臟膿腔占位的影像學(xué)結(jié)果，也能作出肺炎克雷伯菌肝膿腫的推測性診斷，但如果 是早期的肝膿腫，膿腔隱匿，影像學(xué)上表現(xiàn)不明顯，如不加以注意，就容易漏診。加之，血培 養(yǎng)耗時(shí)長，從血培養(yǎng)陽性報(bào)警，到最后鑒定出菌種，還需要24-48小時(shí)，耽誤肺炎克雷伯菌 肝膿腫的診斷。
[0005] 本發(fā)明目的在于找到致肝膿腫肺炎克雷伯菌的特異性因子，從而通過簡單、快速 的PCR方法篩查這些因子在血培養(yǎng)陽性患者血液中的存在情況，如特異性因子PCR結(jié)果陽 性，說明該患者血中很可能存在致肝膿腫肺炎克雷伯菌，提示臨床醫(yī)生該患者患肺炎克雷 伯菌肝膿腫概率很高，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生及時(shí)開具肺炎克雷伯菌肝膿腫相關(guān)的檢查，提高 肺炎克雷伯菌肝膿腫的診斷速度，及時(shí)治療，為改善患者預(yù)后提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供了致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm，所述的基 因特異性序列為SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm的 引物：
[0008]sdm_F：TTGAATCTTACCCAGAGGAACTT
[0009]sdm_R：AACAGCACCTTTCACAACGACAT
[0010] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm或 基于sdm設(shè)計(jì)的引物在制備致肝膿腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括用于制備肺 炎克雷伯菌肝膿腫早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0012] 致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm，所述的基因特異性序列為SEQID NO. 1所示。
[0013] 致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm的引物，基于sdm序列設(shè)計(jì)的引物均 為本發(fā)明的保護(hù)范圍，優(yōu)選的，sdm的引物為：sdm_F:TTGAATCTTACCCAGAGGAACTT;sdm_R: AACAGCACCTTTCACAACGACAT〇
[0014] 致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列sdm或基于sdm設(shè)計(jì)的引物在制備致肝膿 腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括以sdm序列為有效標(biāo)記物在制備致肝膿腫肺炎 克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，或者以基于sdm序列設(shè)計(jì)的引物為有效組分在制備致肝膿 腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，或者序列sdm或基于sdm設(shè)計(jì)的引物在制備肺炎克 雷伯菌肝膿腫診斷試劑盒中的應(yīng)用，該試劑盒還可用于肺炎克雷伯菌肝膿腫早期診斷。
[0015] -種致肝膿腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒，包括：
[0020] 一種致肝膿腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒，包括：
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0028]目前對(duì)致肝膿腫肺炎克雷伯菌分子特征的研究主要局限于篩查普遍報(bào)道過的微 生物毒力基因，且特異性不好。本發(fā)明通過2株分離自中國大陸的致肝膿腫肺炎克雷伯菌， 對(duì)其基因組進(jìn)行測序，綜合了第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequencing，NGS)，比較 基因組學(xué)（ComparativeGenomics)及生物信息學(xué)（Bioinformatics)方法，并采用科學(xué)的 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，更全面、更系統(tǒng)地尋找分析致肝膿腫肺炎克雷伯菌的特異性基因。
[0029] 目前尚無很好的用于肺炎克雷伯菌肝膿腫診斷的分子標(biāo)志物，而本發(fā)明獲得了致 肝膿腫肺炎克雷伯菌三段特異性序列，該序列具有很高的特異性，可以用于肺炎克雷伯菌 肝膿腫的診斷，具有商業(yè)化開發(fā)價(jià)值。
[0030] 申請(qǐng)人從細(xì)菌全基因組組學(xué)角度出發(fā)，從臨床分離到致肝膿腫肺炎克雷伯菌和非 肝膿腫患者血液中分離的肺炎克雷伯菌，送全基因組測序，測序結(jié)果與網(wǎng)上公布的致肝膿 腫肺炎克雷伯菌和非致肝膿腫肺炎克雷伯菌全基因組比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾個(gè)與致肝膿高 度相關(guān)的肺炎克雷伯菌基因，分別為sdm、lak和asnC。申請(qǐng)人進(jìn)一步用sdm、lak、asnC的特 異性引物分別在臨床分離的致肝膿腫和非致肝膿腫肺炎克雷伯菌中做了測試，結(jié)果顯示： 在致肝膿腫肺炎克雷伯菌中，sdm的陽性率達(dá)100%，lak和asnC的陽性率為82%以上；在 非致肝膿腫肺炎克雷伯菌中，3個(gè)基因的檢出率全為0%，結(jié)果說明這3個(gè)基因都具有很高 的特異性，可以作為診斷肺炎克雷伯菌肝膿腫的分子標(biāo)志物。此發(fā)現(xiàn)為臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室 人員診斷肺炎克雷伯菌肝膿腫提供依據(jù)，特別是在血液等其他體液來源標(biāo)本的培養(yǎng)結(jié)果正 式報(bào)告前，利用患者血液標(biāo)本或肝臟膿腔膿液，采用快速的PCR方法檢測致肝膿腫肺炎克 雷伯菌特異性基因sdm、lak和asnC的有無，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和影像學(xué)資料，可以快速對(duì) 肺炎克雷伯菌肝膿腫做出診斷，提高肺炎克雷伯