一種用于檢測豬疫病病原微生物的基因芯片及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬疫病病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測豬疫病病原 微生物的基因芯片及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)迅猛發(fā)展，豬病的發(fā)生對規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害日趨加重，特 別是傳染性疾病，成為嚴(yán)重影響我國規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的主要疫病。我國豬病的 種類越來越多，而且近幾年新增疫病不少，疾病的復(fù)雜程度不斷加劇，甚至老病新病混合感 染，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率明顯上升，致使豬場在經(jīng)濟上遭受重大損失。在臨床上，豬病以病 原體的多重感染或混合感染為主要流行形式，豬群發(fā)病往往不是以單一病原體所致，而是 以兩種或多種病原體相互協(xié)同作用所造成的，常常導(dǎo)致豬群的高發(fā)病率和高死亡率，危害 極其嚴(yán)重，而且控制難度加大。繼發(fā)感染現(xiàn)象在規(guī)?；i場也十分普遍，特別是在豬群存在 一些原發(fā)性感染（如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病病毒等）情況 下，一旦應(yīng)激因素和飼養(yǎng)管理不良，就很容易發(fā)生繼發(fā)感染。這種情況在豬呼吸道疾病中， 表現(xiàn)得最為明顯。豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型感染豬群可繼發(fā)豬鏈球菌病、 仔豬副傷寒、副豬嗜血桿菌感染、豬傳染性胸膜肺炎等。豬群感染傳染病之后，多病原混合 感染和繼發(fā)感染現(xiàn)象的存在，增加了臨床診斷的難度，因此在實驗室進行病原檢測，成為診 斷豬群疫病感染行之有效的方法。目前對豬源疾病的診斷，多采用病原分離及常規(guī)的血清 學(xué)方法，但病原分離不僅費時費力，而且敏感性和特異性都較差，血清學(xué)診斷方法也因?qū)嶒?室條件和診斷方法的不同而產(chǎn)生不同的差異；雖然已有PCR診斷方法應(yīng)用于病毒檢測，但 需分別進行診斷。因此，研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性好且能夠同時檢出多種病原微生 物的基因芯片，對養(yǎng)豬業(yè)疫情預(yù)警與防控，具有十分重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬疫病病原微生物的基因 芯片及其檢測方法。該基因芯片能夠同時對10種豬疾病病原微生物實現(xiàn)快速、特異、靈敏 的檢測。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0005] -種用于檢測豬疫病病原微生物的基因芯片，包括固定在固相載體上的與待檢致 病病原微生物相對應(yīng)的寡核苷酸探針和陽性質(zhì)控；
[0006] 所述寡核苷酸探針分別為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針、豬瘟病毒探針、豬副 嗜血桿菌探針、豬流感病毒探針、豬肺炎支原體探針、豬圓環(huán)病毒II型探針、豬細小病毒探 針、豬藍耳病毒探針、豬偽狂犬病病毒探針和豬鏈球菌探針，其分別相應(yīng)于SEQ ID N0. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9 和 10 的序列；
[0007] 所述陽性質(zhì)控為美國INDVER公司提供的生物素標(biāo)記的陽性質(zhì)控基因片段；用于 監(jiān)控基因芯片檢測方法的有效性。
[0008] 所述固相載體為帶有正電荷的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜或尼龍膜。 綜合考慮上述固相載體的使用效果、使用方便性、儲存方便性及保質(zhì)期等因素，本發(fā)明優(yōu)選 玻璃片作為固相載體。
[0009] 上述基因芯片，其陽性質(zhì)控呈"T"字型分布；與待檢致病病原微生物相對應(yīng)的寡 核苷酸探針呈微陣列分布。
[0010] 上述基因芯片的制備方法，步驟為：將寡核苷酸探針點樣在固相載體上，點好樣的 固相載體在長波紫外燈下進行交聯(lián)；同時將陽性質(zhì)控點樣在固相載體上，即制得基因芯片。
[0011] 本發(fā)明還提供了用于特異性擴增豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬瘟病毒、豬副嗜 血桿菌、豬流感病毒、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒II型、豬細小病毒、豬藍耳病毒、豬偽狂犬 病病毒和豬鏈球菌病原微生物特定保守核苷酸序列的引物，其分別相應(yīng)于SEQ ID N0. 11至 SEQ ID NO. 30所示的序列。
[0012] 上述用于特異性擴增的引物序列，具體如下：
[0013] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌：F:5 ' GCGGTAATGGCGATGACAC 3 ' (SEQ ID N0. 11)
[0014] R:5 ' TOGATATCTCTTGCGCGGTTA 3 ' (SEQ ID NO. 12)
[0015] 豬瘟病毒：F:5 ' GACTAGCAAACGGAGGGACTA 3 ' (SEQ ID NO. 13)
[0016] R:5 ' GCCAGGGTTAAGGTGTGTCT 3 ' (SEQ ID NO. 14)
[0017] 豬副嗜血桿菌：F:5 ' TGATGAGGAAGGGTGGTGTTT 3 ' (SEQ ID NO. 15)
[0018] R:5 ' TACGCCCAGTCATTCCGATTA 3 ' (SEQ ID NO. 16)
[0019] 豬流感病毒：F:5 ' TTATGCTGGAGCAAACAGC 3 ' (SEQ ID NO. I7)
[0020] R:5 ' ACATAGGCATCTGCATTTTGG 3 ' (SEQ ID NO. 18)
[0021] 豬肺炎支原體：F:5 ' GTGATGGGTGAACATGGTGAT 3 ' (SEQ ID NO. 19)
[0022] R:5 ' GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTA 3 ' (SEQ ID NO. 20)
[0023] 豬圓環(huán)病毒 II 型：F:5 ' AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC 3 ' (SEQ ID NO. 21)
[0024] R:5 ' CTCTGTGCCCTTTGAATACTA 3 ' (SEQ ID NO. 22)
[0025] 豬細小病毒：F:5 ' CAGAATCAGCAACCTCACCAC 3 ' (SEQ ID NO. 23)
[0026] R:5 ' GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA 3 ' (SEQ ID NO. 24)
[0027] 豬藍耳病毒：F:5 ' ATGAGTGAACCCGTACTTGTG 3 ' (SEQ ID NO. 25)
[0028] R:5 ' GTTCTGCGATGGTGCTAGG 3 ' (SEQ ID NO. 26)
[0029] 豬偽狂犬病病毒：F:5 ' GTTCAACGAGGGCCAGTACC 3 ' (SEQ ID NO. 27)
[0030] R:5 ' TGAAGCTGTCGTCGCTCCA 3 ' (SEQ ID NO. 28)
[0031] 豬鏈球菌：F:5 ' AGCAGTTCGCACGGACAT 3 ' (SEQ ID NO. 29)
[0032] R:5 ' GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA 3 ; (SEQ ID NO. 30)
[0033] 本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的檢測豬疫病病原微生物的方法，包括如下步 驟：
[0034] (1)提取待檢樣品中的總RNA，作為模板，采用RT-PCR擴增，以SEQ ID N0. 11至 SEQ ID NO. 30所示的序列為擴增引物，并對擴增引物采用生物素標(biāo)記；
[0035] (2)將RT-PCR過程中完成的生物素標(biāo)記的產(chǎn)物進行雙鏈解離，然后與基因芯片進 燈雜父；
[0036] (3)雜交后，通過試劑的添加，完成待測病原微生物核苷酸片段生物素、親和素及 化學(xué)發(fā)光基團的結(jié)合，通過芯片讀取儀（INDVER公司，美國），實現(xiàn)光激活狀態(tài)下的化學(xué)反 應(yīng)，根據(jù)芯片上的顏色變化判斷檢測結(jié)果。
[0037] 步驟⑴中，RT-PCR反應(yīng)體系的組成為：
[0039] 步驟（1)中，RT-PCR擴增的程序為：
[0040] 1) 45 °C 30min ；
[0041] 2)95〇C 2min ；
[0042] 3)95〇C 15s ；
[0043] 4)56〇C 40s ；
[0044] 5)72〇C 15s ；
[0045] 6)回到第3)步，重復(fù)40次。
[0046] 步驟（1)中，采用維生素 Η對擴增引物進行生物素標(biāo)記。
[0047] 本發(fā)明的有益效果：
[0048] 本發(fā)明的基因芯片實現(xiàn)了高效檢測，一次性針對10種豬源病原微生物，大大提高 了檢測效率；實現(xiàn)了 RNA病毒、DNA病毒和細菌在同一反應(yīng)體系中的擴增，節(jié)約了時間，避 免了常規(guī)檢測方法的反復(fù)操作；敏感度高，樣品中核酸含量為pg級同樣可以檢出；特異性 強，本發(fā)明中設(shè)計的引物與探針均具有高度保守性和專屬性，同時對芯片的布局設(shè)立三個 重復(fù)，有效避免了非特異性結(jié)果的出現(xiàn)。
【附圖說明】
[0049] 圖1 :為本發(fā)明的基因芯片模式圖，B系列呈"T"字型，標(biāo)紅處為陽性參照點，1系 列點為3個平行的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針點，2系列點為3個平行的豬瘟病毒探針 點，3系列點為3個平行的豬副嗜血桿菌探針點，4系列點為3個平行的豬流感探針點，5系 列點為3個平行的豬肺炎支原體探針點，6系列點為3個平行的豬圓環(huán)病毒II型探針點，7 系列點為3個平行的豬細小病毒探針點，8系列點為3個平行的豬藍耳病毒探針點，9系列 點為3個平行的豬偽狂犬病毒探針點，10系列點為3個平行的豬鏈球菌探針點；
[0050] 圖2 :豬瘟病毒（CSFV)檢測結(jié)果；
[0051] 圖3 :豬藍耳病毒（PRRSV)檢測結(jié)果；
[0052] 圖4 :豬胸膜肺炎放線桿菌（APP)檢測結(jié)果；
[0053] 圖5 :豬副嗜血桿菌（HPS)檢測結(jié)果；
[0054] 圖6 :豬偽狂犬病病毒（PRV)檢測結(jié)果；
[0055] 圖7 :豬藍耳病毒（PRRSV)和豬偽狂犬病病毒（PRV)檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0056] 結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0057] 實施例1 :基因芯片的制備
[0058] 將設(shè)計的與待檢致病病原微生物相對應(yīng)的寡核苷酸探針點樣在帶有正電荷的玻 璃片（AMI公司，美國）上，點好樣的玻璃片在長波紫外燈下進行交聯(lián)lOmin左右，同時將 0. 2 μ L標(biāo)記有生物素的陽性質(zhì)控也點在每張玻璃片上。陽性質(zhì)控的分布呈"T"字型，與待 檢致病病原微生物相對應(yīng)的寡核苷酸探針呈微陣列分布。該基因芯片的模式圖如圖1所 不。
[0059] 與待檢致病病原微生物相對應(yīng)的寡核苷酸探針的序列如下：
[0060] (1)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌探針
[0061] SEQ ID NO. 1 ：5 ; gcaAAGGTAATGATATTCTAAgaggt
[0062] (2)豬瘟