具有增加的銹病抗性的轉(zhuǎn)基因谷類植物的制作方法
【專利說明】具有增加的銹病抗性的轉(zhuǎn)基因谷類植物
[0001] 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)要求于2013年6月3日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/830，444的權(quán)益，并通 過引用將所述臨時(shí)申請(qǐng)結(jié)合到本文中，如同其此時(shí)被全部列出一樣。
[0002] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明 本發(fā)明在農(nóng)業(yè)部授予的USDA/NIFA批準(zhǔn)號(hào)2011-68002-30029下在美國政府支持下進(jìn) 行。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般地涉及總體上改善農(nóng)作物植物的領(lǐng)域，并且更具體地，涉及具有增加 的銹病抗性的轉(zhuǎn)基因2174小麥品種。
[0004] 發(fā)明背景 小麥為全世界的主要食物作物，但不斷地受到數(shù)種真菌疾病，例如葉銹病和條銹病的 挑戰(zhàn)[1，2]。存在對(duì)于宿主植物對(duì)流行病原體的抗性已經(jīng)定位的許多基因或數(shù)量性狀位點(diǎn) (QTL)，包括對(duì)于條銹病的67個(gè)基因/QTL和對(duì)于葉銹病的49個(gè)基因 /QTL [3]。這些基因 /QTL 的抗性可分為兩種類型：i)完全或質(zhì)量抗性，和ii)部分或數(shù)量抗性[4-11]。質(zhì)量抗性符 合基因?qū)蚰Ｐ?，其中病原體由植物宿主抗性基因識(shí)別，導(dǎo)致病原體的完全排除[12]。數(shù) 量抗性仍然知之甚少，但通過兩種假設(shè)解釋:i)多重抗性基因之間的相互作用的結(jié)果[13， 14]，或ii)病原體效應(yīng)器與植物防御蛋白之間的直接相互作用或病原體效應(yīng)器與該效應(yīng) 器觸發(fā)的植物防御蛋白之間的間接相互作用的結(jié)果[15，16]。
[0005] Lr34是賦予對(duì)引起葉銹病、條銹病和白粉病的真菌病原體的抗性的非種族特異性 基因，其還賦予對(duì)大麥黃矮病毒的抗性[17-20]。由于其對(duì)多種病原體的抗性的持久性和非 特異性，Lr34成為全世界小麥中最重要的疾病抗性基因之一，并且自21世紀(jì)初就已經(jīng)被利 用[21-23]。1^34的克隆表明該基因的抗性等位基因由24個(gè)外顯子和23個(gè)內(nèi)含子組成，從起 始密碼子到終止密碼子跨越11，805 bp的核苷酸序列，并且其編碼多種藥物抗性(PDR)-樣 腺苷三磷酸-結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體，該轉(zhuǎn)運(yùn)體由兩個(gè)單元組成，每個(gè)單元包含一個(gè)胞質(zhì)核苷 酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)和一個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TD) [ 2 ]?？剐缘任换?Lr34r和敏感等位基因 Lr34s可通過三個(gè)多態(tài)性區(qū)分。第一個(gè)為在Lr34Ells等位基因的外顯子11中存在但在 Lr34Ellr等位基因中缺失的編碼苯丙氨酸的密碼子TTC，第二個(gè)為外顯子12中從"C"至"T" 的點(diǎn)突變，產(chǎn)生Lr34E12S蛋白中的酪氨酸殘基和Lr34E12r蛋白中的組氨酸殘基[2，18]。第 三個(gè)為Lr34E22s在外顯子22中包含一個(gè)點(diǎn)突變，產(chǎn)生過早的終止密碼子和缺乏覆蓋大部分 第二跨膜結(jié)構(gòu)域的185個(gè)氨基酸的縮短的、無功能Lr34E22s蛋白[2，18，22，24]。三個(gè)突 變中的每個(gè)均已在蛋白水平表征但未在轉(zhuǎn)錄水平表征。
[0006] 先前在適應(yīng)南部大平原的冬小麥品種上的研究表明Lr34是自攜帶敏感Lr34等位 基因的"Jagger"與攜帶抗性Lr34等位基因的"2174"的成對(duì)雜交的重組自交系(RIL)中葉銹 病反應(yīng)的總表型變異的18-35%的原因[22]。在其它研究中也報(bào)道Lr34是葉銹病反應(yīng)變異的 29-33%的原因[2, 13, 25]。然而，該基因賦予的部分抗性的分子機(jī)制在很大程度上仍是未 知的。因此，Lr34基因在小麥育種中的部署仍基于傳統(tǒng)的育種方法，通過該方法將來自供體 的抗性等位基因引入攜帶敏感等位基因的受體品種。
[0007] 對(duì)Lr34轉(zhuǎn)錄缺陷和其對(duì)進(jìn)一步的下游或上游蛋白的作用的徹底理解將明顯有助 于建立持久的疾病抗性途徑，并允許基因工程改造抗銹病和其它真菌疾病的小麥。
[0008] 發(fā)明概述 Lr34是一個(gè)賦予對(duì)真菌病原體包括葉銹病、條銹病、莖銹病和白粉病，以及大麥黃矮病 毒的抗性的非種族特異性基因。由于其對(duì)多種病原體的抗性的持久性和非特異性，Lr34成 為全世界小麥中最重要的疾病抗性基因之一。然而，Lr34的抗性為部分的，因此其被稱為 "微效"基因。
[0009] 本公開內(nèi)容描述了成為小麥成株（Triticum aestivum，2n=6x=42，AABBDD)中 Lr34對(duì)葉銹病的部分抗性的基礎(chǔ)的新機(jī)制。如下面所更充分解釋的，在攜帶抗性Lr34等位 基因的品種中，由于多個(gè)錯(cuò)誤剪接事件導(dǎo)致，僅一部分(35%)的其轉(zhuǎn)錄物正確剪接并且大部 分(65%)的其轉(zhuǎn)錄物不正確地剪接。Lr34剪接對(duì)低溫敏感，與成株相比，其在幼苗中產(chǎn)生更 高比例的和更多形式的錯(cuò)誤剪接轉(zhuǎn)錄物。從錯(cuò)誤剪接的cDNA推導(dǎo)的蛋白在長度上為不完整 的并且缺乏TaFKBPl (小麥(T. aestivum)中第一個(gè)表征的親免蛋白）的相互作用位點(diǎn)。 [0010]然而，當(dāng)在攜帶抗性等位基因的轉(zhuǎn)基因品種中過表達(dá)正確剪接的Lr34 cDNA時(shí)，功 能性Lr34轉(zhuǎn)錄物水平顯著增加并且轉(zhuǎn)基因小麥顯示增加的葉銹病抗性。這些發(fā)現(xiàn)顯示可通 過克服錯(cuò)誤剪接的作用增加數(shù)量基因賦予的抗性水平。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述 圖1A-K.衍生自Lr34的錯(cuò)誤剪接的cDNA的結(jié)構(gòu)。A，由24個(gè)外顯子和23個(gè)內(nèi)含子組成的 Lr34基因結(jié)構(gòu)。B，正確剪接的Lr34 mRNAX-I，左部分:作為跳躍或盒式外顯子(CE)、內(nèi)含子 保留（IR)、選擇性3 '剪接位點(diǎn)(A3SS)和選擇性5 '剪接位點(diǎn)(A5SS)描述的選擇性剪接事件的 位置。C，部分外顯子10跳躍，外顯子10的5'末端處的92 bp (C1)和11 bp (C2KD，外顯子12 的5末端處的44 bp跳躍。E，完整的外顯子16跳躍。F，完整的內(nèi)含子1保留。G，完整的內(nèi)含子 9保留。H，完整的內(nèi)含子14保留。I，內(nèi)含子6分別以該內(nèi)含子3'末端處的12 bp (G1)或17 bp (G2)部分保留。C-I，右部分，Lr34推導(dǎo)的蛋白。灰箱指示外顯子，線指示內(nèi)含子，虛線箱指示 跳躍的外顯子，黑箱指示保留的內(nèi)含子，星形指示mRNA中錯(cuò)誤剪接的片段，心形指示過早的 終止密碼子。J，Jagger的無功能LT3H2174的功能性Lr34的蛋白結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)單元組成， 每個(gè)單元包含一個(gè)胞質(zhì)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NBD)和一個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域(TD)。
[0012] 圖2A-C.活細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的Lr34和TaFKBPl蛋白的亞細(xì)胞定位和體內(nèi)相互作 用。A，PEG101表達(dá)的TaFKBPl-YFP蛋白在細(xì)胞質(zhì)膜(M)以及核(N)上的亞細(xì)胞定位。該圖像用 明亮濾光器(BF)獲取以指示用攜帶構(gòu)建體的根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)浸潤的葉的背 景，或用紫外濾光器(DAPI)獲取以指示用f，6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核的位置。疊加 的圖像對(duì)齊GFP的位置與DAPI-染色的核。B，PEG101表達(dá)的兩個(gè)Lr34-YFP蛋白片段{(1-510 位和750-1401 (末端)位的氨基酸）}在煙葉活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中的亞細(xì)胞定位。C，Lr34和 TaFKBP 1蛋白的B iFC分析。黃色熒光蛋白由Lr 34-YN與TaFKBP 1-YC之間的體內(nèi)相互作用導(dǎo) 致。圖像在具有GFP濾光器的熒光顯微鏡下獲取以指示當(dāng)Lr34和YC載體相互作用或 TaFKBPl和YN載體相互作用用作陰性對(duì)照時(shí)信號(hào)的缺失。所有圖像的比例尺均表示50 μπι。
[0013] 圖3A-D. TaFKBPl對(duì)疾病抗性的遺傳效應(yīng)。A，TaFKBP-Al的PCR標(biāo)志。PCR產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠中直接電泳，顯示來自Jagger等位基因而非來自2174等位基因的多態(tài)性條帶。 使用中國春缺_四體系（Chinese spring nulli-tetrasomic line)測(cè)定TaFKBP-Al的染色 體定位。052:附41'10;054:附81'10<56:附01'18。8，了3?仙?-81的？0財(cái)示志。在1%瓊脂糖凝膠中 電泳用限制酶Ddel消化的PCR產(chǎn)物。1.未消化的Jagger PCR產(chǎn)物，2.未消化的2174 PCR產(chǎn) 物。3.消化的Jagger PCR產(chǎn)物（750 bp)，4.消化的2174 PCR產(chǎn)物（448 bp)<X，TaFKBP-Al 對(duì)條銹病的作用。D，TaFKBP-Bl對(duì)條銹病的作用。從每年在華盛頓州兩個(gè)位置檢驗(yàn)條銹病的 種群的每個(gè)系U-96)將表型平均(Fang等人，2011)。使用單向方差分析(AN0VA)測(cè)定兩個(gè) TaFKBPl基因?qū)@些疾病抗性的顯著作用。棒指示標(biāo)準(zhǔn)誤差。Y軸指示條銹病抗性的比率。
[0014] 圖4A-D.轉(zhuǎn)基因小麥中過表達(dá)的Lr34的轉(zhuǎn)錄物水平和表型。用與PHAC20載體融合 的Lr34 cDNA轉(zhuǎn)化的冬變種2174的轉(zhuǎn)基因植物。A，使用引物擴(kuò)增覆蓋外顯子10的區(qū)域，成株 葉中的Lr34的轉(zhuǎn)錄物水平。Y軸指示通過2(_AAeT)方法計(jì)算的值，其中CT為閾值循環(huán)，肌動(dòng)蛋 白（actin)用作內(nèi)源對(duì)照。B，使用引物擴(kuò)增覆蓋外顯子12的區(qū)域，成株葉中Lr34的轉(zhuǎn)錄物水 平。C，與野生型植物相比陽性植物上計(jì)數(shù)的膿皰數(shù)目。D，在陽性植物與野生型植物之間比 較的葉銹病膿皰覆蓋的葉面積的百分比。值為16-20個(gè)植物的平均，棒指示標(biāo)準(zhǔn)誤差（± SE)〇
[0015] 圖5A和B. RIL中錯(cuò)誤剪接轉(zhuǎn)錄物的模式比較。A，對(duì)于在三個(gè)環(huán)境/年上平均的百 分比感染分?jǐn)?shù)，選自Jagger X 2174 RIL種群的攜帶抗性Lr34等位基因的60個(gè)重組自交系 (RIL)的頻率分布。B，使用引物L(fēng)r34-DMS-F2和Lr34-DMS-R2擴(kuò)增覆蓋外顯子10 (E10)的區(qū) 域以及使用引物L(fēng)r34-DMS-F2和Lr34-DMS-R2擴(kuò)增覆蓋外顯子12 (E12)的區(qū)域，正常和錯(cuò)誤 剪接的Lr34的表達(dá)。通過與在本研究中測(cè)序和定位的部分同源基因組4A上的Lr34-B (參見 圖9B)和部分同源基因組7A上的Lr34-A (參見圖9A)比較，測(cè)定引物對(duì)Lr34的特異性。如果 cDNA樣品中存在任何gDNA污染，對(duì)Lr34特異的那些引物不能擴(kuò)增gDNA，這是因?yàn)槊繉?duì)中的 一個(gè)覆蓋兩個(gè)外顯子。對(duì)于部分E10跳躍，正常Lr34轉(zhuǎn)錄物的PCR產(chǎn)物大小為597 bp，部分 E10跳躍片段為505 bp。對(duì)于部分E12跳躍，正常Lr34轉(zhuǎn)錄物為414 bp，具有跳躍的部分外顯 子12的片段為370 bpj: DNA梯狀標(biāo)志；泳道1-9:RIL種群中具有抗性Lr34等位基因的9個(gè) 系。泳道10:錯(cuò)誤剪接的cDNA (來自包含錯(cuò)誤剪接的Lr34 cDNA的質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物）。泳道11: 正常cDNA (來自包含正常Lr34 cDNA的質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物）。
[0016] 圖6A和B.小麥品種中錯(cuò)誤剪接的Lr34轉(zhuǎn)錄物。A，使用引物L(fēng)r34-DMS-F2和Lr34- DMS-R2擴(kuò)增覆蓋外顯子10的區(qū)域，錯(cuò)誤剪接的Lr34轉(zhuǎn)錄物。B，使用引物L(fēng)r34-DMS-F3和 Lr34-DMS-R3擴(kuò)增覆蓋外顯子12的區(qū)域，錯(cuò)誤剪接的Lr34轉(zhuǎn)錄物。M.標(biāo)志；1.加88奸；2· 2174;3· OK bullet;4. Duster;5. Billings;6. Endurance;Cl.具有內(nèi)含子9保留的克 隆1;C2.具有部分外顯子10 (92 bp)跳躍的克隆2;C2.具有部分外顯子12 (44 bp)跳躍 的克隆2; C0，具有正確剪接的外顯子和內(nèi)含子的克隆。這些品種的樣品從20 10年 St i 1 lwater、Oklahoma處的田間試驗(yàn)中的成株收集。
[00Π ]圖7 A-C. Lr34中內(nèi)含子6的選擇性位點(diǎn)。A，內(nèi)含子6被正確剪接出并且外顯子6與 外顯子7連接。B，內(nèi)含子6的3'末端處加下劃線的12 bp被保留。C，內(nèi)含子6的3'末端處加下 劃線的17 bp被保留。
[0018] 圖8 A和B. TaFKBP-Al和TaFKBP-Bl的染色體位置。A，染色體1A長臂上的TaFKBP- A13，染色體1B長臂上的TaFKBP-Bl。
[0019] 圖9A-C· Lr34-A、Lr34-B和Lr34基因的基因連鎖圖。Lr34-A和Lr34-B的染色體定 位已有報(bào)道[26]，但其序列尚未在GenBank中發(fā)布。對(duì)于兩個(gè)部分同源基因的每個(gè)，測(cè)序了 兩個(gè)等位基因的每個(gè)，Jagger等位基因和2174等位基因的Lr34-A，Jagger等位基因和2174 等位基因的Lr34-B。A，Lr34-A定位在染色體7A上。B，Lr34-B定位在代表來自染色體7B的易 位片段的染色體4A上。藍(lán)棒指示從染色體7B易位的片段。C，Lr34定位在染色體7D上[2]。 Lr34-A基因通過使用引物L(fēng)r34-X-F2與引物L(fēng)r34-In2-Rl組合在下列條件下PCR定位:94°C 變性3 min，以每個(gè)循環(huán)94°C 30 s，55°C 30 s和72°C 1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，和72°C最終延 伸10 miruPCR產(chǎn)物通過在1%瓊脂糖凝膠上電泳表征。對(duì)于Lr34-A，2174等位基因顯示734 bp的帶，Jagger等位基因顯示439 bp的帶。Jagger與2174等位基因之間在12 kb Lr34-B基 因中僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)多態(tài)性-內(nèi)含子1中的一個(gè)"T"插入/缺失，Jagger中8個(gè)"T"重復(fù)，2174中9個(gè) "T"重復(fù)。通過使用引物L(fēng)r34B-5-Fl和Lr34-In2Rl以及下列PCR條件測(cè)序種群的每個(gè)系定位 Lr34-B:94°C變性3 min，以每個(gè)循環(huán)94°C 30 s，58°C 30 s和72°C 1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，和 72°C最終延伸 10 min。然后用Wizard SV凝膠和PCR Clean-Up系統(tǒng)（Promega, Madison, WI，USA)純化PCR產(chǎn)物，并直接測(cè)序純化的PCR產(chǎn)物。遺傳圖在96 RIL的Jagger X 2174種 群中構(gòu)建。
[0020] 圖10A和B.