中和IL-1β的人單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗原結(jié)合蛋白，且具體涉及IL-Ιβ抗原結(jié)合蛋白。更具體地，本發(fā)明涉 及所述結(jié)合蛋白的序列及重鏈和輕鏈。本發(fā)明還提供了包含該抗原結(jié)合蛋白的組合物、該 抗原結(jié)合蛋白的應(yīng)用及制備方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 白介素細(xì)胞_1β( IL-Ιβ)是白介素細(xì)胞-1細(xì)胞因子家族的成員，并且是炎癥反應(yīng)的 重要介質(zhì)。其為促炎癥細(xì)胞因子，且參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡。
[0004] IL-Ιβ的過表達(dá)與許多炎性疾病和自身免疫疾病有關(guān)，如冷吡啉相關(guān)的周期性綜 合征和相關(guān)病癥、糖尿病、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎細(xì)胞癌、痛風(fēng)和炎性痤瘡。
[0005] 本發(fā)明一個目的是提供對IL-Ιβ具有特異性的抗原結(jié)合蛋白，其能夠中和IL-Ιβ的 活性，以預(yù)防或治療與IL-Ιβ產(chǎn)生升高相關(guān)的疾病。
[0006] 目前，已有靶向IL-Ιβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的3種生物制劑被批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用：阿那白 滯素(anakinra)(IL-l受體詰抗劑）、利納西普(rilonacept)(包含IL-1受體1的融合蛋白） 和卡那單抗(canakinumab)(單克隆抗體）。
[0007] 除了以上所述的3種批準(zhǔn)的IL-1阻滯劑，目前人源化單克隆抗體X0MA-052 (gevokizumab)處在臨床研發(fā)中。每種分子均表現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制并展現(xiàn)不同的交叉反 應(yīng)性和藥理特性。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 根據(jù)第一個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其包含選自以下結(jié)合 單元的一個或多個結(jié)合單元：
[0010] (i)結(jié)合單元L1，包含SEQ ID N0:3的Kabat殘基23-35或SEQ ID N0:4、15或 16的 Kabat殘基24-33或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元L1中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0011] (ii)結(jié)合單元L2,包含SEQ ID N0:3的Kabat殘基51-57或SEQ ID N0:4、15或 16的 Kabat殘基49-55或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元L2中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0012] (iii)結(jié)合單元L3，包含SEQIDN0:3的Kabat殘基92-102或SEQIDN0:4、15或16 的Kabat殘基88-96或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元L3中含有至少一個氨基酸替 換、插入或缺失；
[0013] (iv)結(jié)合單元H1，包含SEQ ID N0:1 的Kabat殘基31-35或SEQ ID N0:2或 14的 Kabat殘基31-35或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元H1中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失；
[0014] (v)結(jié)合單元H2,包含SEQ ID NO: 1 的Kabat殘基50-66或SEQ ID N0: 2或 14的Kabat 殘基50-65或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元H2中含有至少一個氨基酸替換、插入或 缺失;和
[0015] (vi)結(jié)合單元H3,包含SEQ ID N0:1 的Kabat殘基99-114或SEQ ID N0:2或 14的 Kabat殘基98-108或它們的變體，所述變體在所述結(jié)合單元H3中含有至少一個氨基酸替換、 插入或缺失。
[0016]根據(jù)第二個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其在細(xì)胞刺激檢測中 以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM、小于InM、小于0.5nM或小于0.2nM的 IC50 值中和 IL-Ιβ。
[0017]根據(jù)第三個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其在細(xì)胞抑制檢測中 以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于InM、小于0.5nM或小于 0.4nM的IC50值抑制IL-1 β誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生。
[0018] 根據(jù)第四個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其以小于ΙΟηΜ、小于 5nM、小于2nM、小于InM、小于0.5nM，或小于O.lnM的Kd值結(jié)合IL-Ιβ。
[0019] 根據(jù)第五個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其以1-lOOpM的IC50 值中和人IL-Ιβ。
[0020] 根據(jù)第六個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其以ΙΟΟ-ΙΟΟΟρΜ的 IC50值中和鼠 IL-Ιβ。
[0021] 根據(jù)第七個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白對 人IL-Ιβ具有1-100ρΜ的親和力(KD)。
[0022] 根據(jù)第八個方面，提供了分離的IL-Ιβ特異性抗原結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白對 鼠 IL-Ιβ具有5-200pM的親和力(KD)。
[0023]根據(jù)第九個方面，提供了前述方面中任一方面的分離的抗原結(jié)合蛋白在治療癌 癥、炎性疾病或自身免疫疾病中的應(yīng)用，所述炎性疾病或自身免疫疾病選自：關(guān)節(jié)炎、炎性 腸道疾病、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相關(guān)的周期性綜 合征和炎性痤瘡。
[0024] 根據(jù)第十個方面，提供了如以上所定義的分離的抗原結(jié)合蛋白在制備用于治療癌 癥、炎性疾病或自身免疫疾病的藥物中的應(yīng)用，所述炎性疾病或自身免疫疾病選自：關(guān)節(jié) 炎、炎性腸道疾病、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、糖尿病、葡萄膜炎、冷_林相關(guān)的周 期性綜合征和炎性痤瘡。
[0025] 根據(jù)第十一個方面，提供了組合物，其包含如以上所定義的抗原結(jié)合蛋白和藥學(xué) 上可接受的載體。
[0026] 根據(jù)第十二個方面，提供了分離的細(xì)胞系，其能夠產(chǎn)生如以上所定義的抗原結(jié)合 蛋白。
[0027]根據(jù)第十三個方面，提供了分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或14或它們的片段的序列或由其組成。
[0028]根據(jù)第十四個方面，提供了分離的核酸分子，其包含選自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4、15或16或它們的片段的序列或由其組成。
[0029]根據(jù)第十五個方面，提供了包含如以上所定義的核酸分子的載體。
[0030]根據(jù)第十六個方面，提供了包含如以上所定義的核酸分子的宿主細(xì)胞。
[0031 ]根據(jù)第十七個方面，提供了包含如以上所定義的載體的宿主細(xì)胞。
[0032]根據(jù)第十八個方面，提供了制備如以上所定義的抗原結(jié)合蛋白的方法，包括在合 適的條件下培養(yǎng)如以上所定義的宿主細(xì)胞，以及從中回收所述蛋白。
[0033] 根據(jù)第十九個方面，提供了治療癌癥、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述炎性 疾病或自身免疫疾病選自：關(guān)節(jié)炎、炎性腸道疾病、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、糖 尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相關(guān)的周期性綜合征和炎性痤瘡，其中將如以上所定義的分離的抗 原結(jié)合蛋白給予至對象。
[0034] 定義
[0035]本文所用的以下詞語和術(shù)語應(yīng)具有如下所表明的含義：
[0036]如本文所用，術(shù)語"抗原結(jié)合蛋白"是指抗體、抗體片段和其他蛋白構(gòu)建體如結(jié)構(gòu) 域，其能夠結(jié)合IL-Ιβ。
[0037] 如本文所用，術(shù)語"抗體"在廣義上是指具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的分子，并且包 括單克隆、重組的、多克隆、嵌合的、人源化的、雙特異性、多特異性和異源綴合抗體;單個可 變結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域抗體、抗原結(jié)合片段、免疫有效片段、單鏈Fv、雙價抗體、Tandabs?等(關(guān)于 替代性"抗體"形式的綜述，參見 Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005， Vol23,No.9,1126-1136)〇
[0038] 詞語"單個可變結(jié)構(gòu)域"是指特異性結(jié)合抗原或表位的抗原結(jié)合蛋白可變結(jié)構(gòu)域 (例如，￥^^、1)，其與不同的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域無關(guān)。
[0039] "結(jié)構(gòu)域抗體"或"dAb"可看做與"單個可變結(jié)構(gòu)域"相同，其能夠結(jié)合抗原。單個可 變結(jié)構(gòu)域可為人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但還包括來自其他物種的單個抗體可變結(jié)構(gòu)域，如嚙齒 類(例如，公開于W0 00/29004中的）、護(hù)士鯊和駱駝科的VHH dAb。駱駝科的Vhh為免疫球蛋白 單個可變結(jié)構(gòu)域多肽，其來源的物種包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝(guanaco)， 其產(chǎn)生天然缺少輕鏈的重鏈抗體。這類Vhh結(jié)構(gòu)域可根據(jù)本領(lǐng)域中可用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行人源 化，且這類結(jié)構(gòu)域被看做"結(jié)構(gòu)域抗體"。如本文所用，VH包括駱駝科的Vhh結(jié)構(gòu)域。
[0040] 如本文所用，術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"是指這樣的折疊蛋白結(jié)構(gòu)，其具有獨(dú)立于蛋白的其余 部分的三級結(jié)構(gòu)。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能特性，并且在很多情況下可被添加、 移除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白，而不失去該蛋白的剩余部分和/或該結(jié)構(gòu)域的功能。"單個可變結(jié) 構(gòu)域"是折疊的多肽結(jié)構(gòu)域，其包含具有抗體可變結(jié)構(gòu)域特性的序列。因而，其包括完整的 抗體可變結(jié)構(gòu)域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域，例如，其中一個或多個環(huán)已經(jīng)被不具有抗體可變結(jié) 構(gòu)域特性的序列替代，或已經(jīng)被截短或包含N或C末端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少保 留全長結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。結(jié)構(gòu)域可結(jié)合抗原或表位， 而與不同可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域無關(guān)。
[0041] 可通過在非抗體蛋白骨架如結(jié)構(gòu)域上排列一個或多個CDR的方式來提供抗原結(jié)合 片段。該結(jié)構(gòu)域可為結(jié)構(gòu)域抗體，或者可為這樣的結(jié)構(gòu)域，其為選自以下的骨架的衍生物： CTLA-4(Evibody );脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域（親和體 (八打:113〇(15〇,3卩八）、八-結(jié)構(gòu)域(八￥；[11161'/]\^叉;[130(150;熱休克蛋白如61'(^1和61'(^3;轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Trans-body);錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPin);肽適體;C-型凝集素結(jié)構(gòu)域（四連接素）；人γ -晶 體蛋白和人泛素 (aff ilin) ;Η)Ζ結(jié)構(gòu)域;人蛋白酶抑制劑的蝎毒素 Kunitz型結(jié)構(gòu)域;和纖連 蛋白（adnectin);其已經(jīng)接受蛋白質(zhì)改造以便獲得對除其天然配體以外的配體的結(jié)合。 [0042] CTLA_4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)的抗原4)是主要表達(dá)于⑶4+T-細(xì)胞上的⑶28-家 族受體。其胞外結(jié)構(gòu)域具有可變結(jié)構(gòu)域樣Ig折疊。對應(yīng)于抗體的CDR的環(huán)可用異源序列替代 以賦予不同的結(jié)合特性。經(jīng)改造的具有不同結(jié)合特異性的CTLA-4分子也稱為Evibody。詳情 參見，Journal of Immunological Methods 248(1-2)，31_45(2001)〇[0043]脂質(zhì)運(yùn)載蛋白為胞外蛋白家族，其轉(zhuǎn)運(yùn)小疏水分子，如類固醇、后膽色素類、類維 生素 A和脂類。它們具有在錐形結(jié)構(gòu)的開口端帶有多個環(huán)的剛性β_折疊二級結(jié)構(gòu)，其可經(jīng)改 造以結(jié)合不同的革G抗原。Anticalin的大小為160-180個氨基酸，且源自脂質(zhì)運(yùn)載蛋白。詳情 參見，Biochim BiophysActa 1482:337-350(2000)、US7250297B1 和US20070224633。
[0044] 親和體是源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的骨架，其可經(jīng)改 造以結(jié)合抗原。該結(jié)構(gòu)域由約58個氨基酸的三螺旋束組成。已經(jīng)通過表面殘基的隨機(jī)化生 成了文庫。詳情參見，Protein Eng.Des.Sel. 17,455-462(2004)和EP1641818A1。
[0045] Avimer是源自A-結(jié)構(gòu)域骨架家族的多結(jié)構(gòu)域蛋白。約35個氨基酸的天然