用于體外受精技術(shù)的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和質(zhì)量控制的制作方法
【專利說明】用于體外受精技術(shù)的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和質(zhì) 量控制
[0001] 相關(guān)專利申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2013年3月14日提交的、名稱為"用于體外受精技術(shù)的基于分子的小 鼠胚胎分析的方法和質(zhì)量控制"的美國臨時(shí)專利申請第61/783, 557號的優(yōu)先權(quán)，該美國臨 時(shí)申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及評價(jià)細(xì)胞生物學(xué)（例如，體外受精）中使用的產(chǎn)品的方法。本發(fā)明還 公開了用于臨床輔助生殖技術(shù)（ART)的質(zhì)量控制分析方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 體外受精（IVF)實(shí)驗(yàn)室在治療不能生育的夫妻方面發(fā)揮重要作用。確保IVF實(shí)驗(yàn) 室中合適的質(zhì)量控制（QC)對于任何IVF項(xiàng)目的成功而言都是至關(guān)重要的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室環(huán)境 可改變所產(chǎn)生的胚胎的質(zhì)量。最優(yōu)的培養(yǎng)基和穩(wěn)定的環(huán)境對于人胚胎體外成功發(fā)育而言是 必需的。胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室的最終作用是在女性生殖道之外的環(huán)境中保持配子和胚胎的固有生 存能力。植入前胚胎發(fā)育的動態(tài)性是獨(dú)一無二的，因?yàn)榕咛ゲ幌耋w細(xì)胞培養(yǎng)物那樣，胚胎在 形態(tài)和功能方面不斷且快速地發(fā)生變化（Leese 1991 ;Bavister 1995)。
[0005] 在發(fā)育過程中，植入前胚胎僅在幾天的過程中就在母本轉(zhuǎn)錄本的基因控制下從 新陳代謝靜止的未分化的單個細(xì)胞快速轉(zhuǎn)變成動態(tài)的多細(xì)胞胚胎，該動態(tài)的多細(xì)胞胚胎 已發(fā)育出了自我平衡機(jī)制及其自身功能基因組（Leese 1991 ;Lane 2001 ;Gardner et al. 2005)。早期胚胎依賴于基于丙酮酸酯的代謝并且僅依賴于線粒體氧化磷酸化作用產(chǎn)生 能量；與單細(xì)胞生物體相似，所述早期胚胎缺乏很多用于pH和滲透控制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。 在8細(xì)胞期至16細(xì)胞期（取決于物種）進(jìn)行壓縮之后，代謝控制變成高度糖酵解代謝。同 時(shí)，隨著胚胎生理學(xué)變得更加類似于體細(xì)胞，在其他細(xì)胞機(jī)制的功能復(fù)雜性方面也存在顯 著的轉(zhuǎn)變。該顯著的轉(zhuǎn)變是早期胚胎及其在植入前發(fā)育的后期階段的后續(xù)發(fā)育過程中自我 平衡調(diào)節(jié)的最初的天然特性，這種最初的天然特性在實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生很大的挑戰(zhàn)。維持有利 的體外環(huán)境對于最大化生存能力以及促進(jìn)不斷發(fā)育而言是必需的。
[0006] 相對于生殖道中遭遇的"正常"條件，培養(yǎng)物的發(fā)育過程中胚胎周圍的環(huán)境的擾 動導(dǎo)致胚胎生存能力降低以及發(fā)育受損。如下文所討論的，本領(lǐng)域需要用于測試在人IVF 中使用的物質(zhì)的胚胎毒性以及生長促進(jìn)因素和抑制因素的客觀、靈敏且可重復(fù)的方法和分 析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在本領(lǐng)域中，通常難以使用形態(tài)作為標(biāo)志物來評價(jià)次優(yōu)環(huán)境對胚胎和其他細(xì)胞的 影響。例如，在一些情況下，發(fā)育成看起來形態(tài)正常的囊胚的胚胎事實(shí)上可能不完全正?；?健康。例如，這種看起來形態(tài)正常的囊胚可在細(xì)胞水平上受到損傷。損傷的囊胚的植入能 力和產(chǎn)生成功的足月妊娠的能力可能降低。在收集和培養(yǎng)過程中胚胎所暴露的環(huán)境可顯著 改變胚胎的發(fā)育可能性和細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。小鼠胚胎分析方法（MEA)是檢查不涉及人類物質(zhì) 的培養(yǎng)基和環(huán)境的適用性的金標(biāo)準(zhǔn)。用于執(zhí)行MEA的基本摶術(shù)和規(guī)稈在體外夸精和懷胎轉(zhuǎn) 移：基本技術(shù)指南（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer:A Manual of Basic Techniques，Don P.Wolf，編輯，1988,第57-75頁）中列舉，該參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容通過引 用并入本文。簡言之，分析方法涉及用孕馬血清促性腺激素（PMSG)和人絨毛膜促性腺激素 (hCG)使雌性小鼠超數(shù)排卵。在注射hCG時(shí)將所述雌性小鼠與雄性小鼠放在一起，并在注射 hCG之后24小時(shí)殺死所述雌性小鼠以獲得單細(xì)胞胚胎或在注射hCG之后36小時(shí)殺死所述 雌性小鼠以獲得兩細(xì)胞胚胎。如果單細(xì)胞胚胎具有兩個極體可見物，選擇使用單細(xì)胞胚胎， 如果兩細(xì)胞胚胎看起來形態(tài)正常，那么選擇使用兩細(xì)胞胚胎。
[0008] MEA用于生殖培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室器具或待與配子和/或胚胎接觸的任何設(shè)備的毒性 和功能性的測試。需要關(guān)于這類測試的信息作為II類輔助生殖設(shè)備的特定控制的基本原 理是這種測試是在輔助生殖設(shè)備中用于配子和/或胚胎的物質(zhì)的潛在毒性的良好的替代 指示。FDA已認(rèn)可了 MEA是目前用于胚胎毒性的最合適的測試。簡言之，使用單細(xì)胞分析 和兩細(xì)胞分析，并且除了單細(xì)胞胚胎相對于兩細(xì)胞胚胎較早地從小鼠輸卵管中沖刷出去之 外，單細(xì)胞分析和兩細(xì)胞分析是等同的。無論使用單細(xì)胞MEA還是兩細(xì)胞MEA，生物分析應(yīng) 當(dāng)盡可能代表所述設(shè)備用于人IVF的相應(yīng)步驟，所述步驟例如，胚胎的獲取、維持、培養(yǎng)、轉(zhuǎn) 移（再定位）以及冷凍保存。通常，在培養(yǎng)96個小時(shí)之后評價(jià)胚胎形態(tài)并確定囊胚的形成。 如果多于80 %的受精卵已達(dá)到囊胚階段，那么所測試的培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)室器具或其他儀器被 認(rèn)為適于臨床應(yīng)用。
[0009] 除了檢測胚胎毒性之外，MEA能夠檢測次優(yōu)原材料、培養(yǎng)基和與IVF和ART有關(guān)的 接觸物質(zhì)。然而，該分析中還有很多通常被忽視的局限性。例如，所述分析可僅檢測嚴(yán)重且 苛刻的胚胎毒性條件。MEA無法在發(fā)育的非常早的階段檢測或區(qū)別生長促進(jìn)因素或生長抑 制因素。
[0010] 本文描述的實(shí)施方式通常涉及提供用作例如體外受精（IVF)環(huán)境和/或輔助生殖 技術(shù)（ART)的質(zhì)量控制的基于分子的小鼠胚胎分析（mMEA)的系統(tǒng)和方法，并且更加具體而 言，本文描述的實(shí)施方式涉及用于評價(jià)從單細(xì)胞期或兩細(xì)胞期至囊胚期的胚胎發(fā)育的改進(jìn) 的分析方法。
[0011] 通過本發(fā)明的描述，結(jié)合其他方面，基于下文的描述和權(quán)利要求書，本發(fā)明的優(yōu)勢 變得清楚和明顯，本發(fā)明的優(yōu)勢由下面部分中所描述的附圖來支持。
[0012] -方面，本發(fā)明提供評價(jià)用于人IVF或ART的產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。所述方法包 括提供轉(zhuǎn)基因胚胎（至少單細(xì)胞）以及體外培養(yǎng)胚胎持續(xù)特定時(shí)間段。所述方法還包括評 估從單細(xì)胞期或兩細(xì)胞期至囊胚期和超過囊胚期的胚胎發(fā)育。所測試的項(xiàng)目的可接受性或 失效基于胚胎發(fā)育的定量和定性分析來確定。任選地，單細(xì)胞胚胎包括可操作地連接至至 少一個胚胎發(fā)育/多能性調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)區(qū)域的至少一個熒光蛋白轉(zhuǎn)基因。
[0013] 轉(zhuǎn)基因可包括編碼所選擇的熒光蛋白的報(bào)告基因，所述熒光蛋白例如綠色熒光蛋 白（GFP)，紅色熒光蛋白，藍(lán)綠色熒光蛋白，桔色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
[0014] 另一方面，所述質(zhì)量控制方法和分析方法被設(shè)計(jì)為評估在IVF環(huán)境和/或ART中 使用的測試項(xiàng)目。所述測試項(xiàng)目可包括配子和胚胎培養(yǎng)基，配子和胚胎處理/加工培養(yǎng)基 (包括洗滌和分離培養(yǎng)基），運(yùn)輸培養(yǎng)基，用于剝離卵母細(xì)胞的酶，精子分離梯度，冷凍/玻 璃化培養(yǎng)基，解凍/加溫培養(yǎng)基，吸管和胚胎處理設(shè)備，在人體外受精過程中使用的實(shí)驗(yàn)室 器具，所述實(shí)驗(yàn)室器具包括但不限于：培養(yǎng)皿，離心管，冷凍保存和低溫貯存設(shè)備以及體外 ART相關(guān)步驟所涉及的任何溶液、試劑或設(shè)備。
[0015] 另一方面，評估胚胎發(fā)育通過分析與胚胎的發(fā)育階段相關(guān)的一般胚胎形態(tài)和/或 熒光位置/數(shù)量/品質(zhì)來完成。優(yōu)選地，所述胚胎來源于哺乳動物，并且可包括鼠胚胎、豬 胚胎、馬胚胎、牛胚胎、綿羊胚胎、兔胚胎和非人類靈長類動物胚胎。
[0016] 再一方面，可操作地連接的胚胎多能性調(diào)節(jié)子可包括但不限于：0ct-4，S 〇x2， Nanog，CDX2和Rexl以及它們的上游介導(dǎo)物和下游效應(yīng)子，所述上游介導(dǎo)物和下游效應(yīng)子 在確保正常胚胎發(fā)育方面發(fā)揮作用。
[0017] 胚胎發(fā)育可在任何或全部階段進(jìn)行評價(jià)，所述階段包括1-細(xì)胞期和2-細(xì)胞期， 4_細(xì)胞期，8-細(xì)胞期，桑葚胚期，囊胚期和原腸胚形成期。
[0018] 本發(fā)明還提供在臨床ART中使用的評估在處理和保存人配子以及產(chǎn)生、培養(yǎng)和保 存人胚胎的過程中使用的產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析方法或試劑盒。所述分析方法有利地包括從 轉(zhuǎn)基因哺乳動物中收獲的轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞胚胎，其中，所述胚胎包括可操作地連接至至少一 個胚胎多能性標(biāo)志物的調(diào)節(jié)區(qū)域的至少一個報(bào)告基因；以及用于評估ART產(chǎn)物和IVF培養(yǎng) 條件的指示。所述指示可包括在一些培養(yǎng)條件下孵育轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞胚胎以及基于來自單細(xì) 胞期和兩細(xì)胞期至囊胚形成期和原腸胚形成期的形態(tài)評估胚胎發(fā)育。
[0019] 任選地，報(bào)告基因編碼熒光蛋白，所述熒光蛋白例如，綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋 白、藍(lán)綠色熒光蛋白、桔色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
[0020] 另一方面，所述分析方法包括至少一個轉(zhuǎn)基因胚胎，其中，所述轉(zhuǎn)基因包括至少一 個胚胎多能性調(diào)節(jié)子和/或其調(diào)節(jié)區(qū)域（例如，上游介導(dǎo)物和/或下游效應(yīng)子），其中，所述 多能性調(diào)節(jié)子在確保正常胚胎發(fā)育方面發(fā)揮作用。測試項(xiàng)目/生長條件可基于胚胎生長、 發(fā)育和品質(zhì)進(jìn)行評估，所述胚胎生長、發(fā)育和品質(zhì)基于對胚胎形態(tài)的評價(jià)和/或熒光定量/ 定性評價(jià)。用于最優(yōu)胚胎生長和發(fā)育的可接受的閾值基于獨(dú)特的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)，所述標(biāo)準(zhǔn)取決 于測試項(xiàng)目和在正常/對照條件下的預(yù)期的發(fā)育。在測試項(xiàng)目不符合相對于正常對照已 確立的接受標(biāo)準(zhǔn)的事件中，所述測試項(xiàng)目可被認(rèn)為是次優(yōu)的或胚胎毒性的（即，不可接受 的）。
[0021] 本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明描述了具有提高的靈敏度的用于臨床人ART/IVF的質(zhì) 量控制的胚胎分析方法。所述分析方法可包括轉(zhuǎn)基因單細(xì)胞胚胎。所述胚胎可包括可操作 地連接至與胚胎發(fā)育有關(guān)的至少一個基因的至少一個報(bào)告基因。優(yōu)選地，所述胚胎在最優(yōu) 和次優(yōu)胚胎條件下差異表達(dá)轉(zhuǎn)基因/報(bào)告基因。另一方面，培養(yǎng)條件是胚胎毒性的。本發(fā) 明還提供測試項(xiàng)目，例如，胚胎培養(yǎng)基，配子處理培養(yǎng)基，用于剝離卵母細(xì)胞的酶，精子分離 梯度，冷凍培養(yǎng)基，解凍培養(yǎng)基，吸管和胚胎處理設(shè)備，或在人體外受精過程中使用的實(shí)驗(yàn) 室器具，所述實(shí)驗(yàn)室器具包括但不限于：培養(yǎng)皿，離心管，冷凍保存和低溫貯存設(shè)備。
[0022] 本文公開的本發(fā)明還包括使用對胚胎發(fā)育至囊胚階段進(jìn)行分析提高胚胎分析方 法的靈敏度的方法。所述方法包括提供轉(zhuǎn)基因胚胎，所述轉(zhuǎn)基因胚胎包括可操作地連接至 至少一個胚胎多能性標(biāo)志物的調(diào)節(jié)區(qū)域的至少一個報(bào)告基因；在使用測試項(xiàng)目的培養(yǎng)條件 下孵育轉(zhuǎn)基因胚胎；以及在形態(tài)上評估胚胎發(fā)育和/或通過從單細(xì)胞期至囊胚期和/或原 腸胚形成期的上述胚胎標(biāo)志物的表達(dá)評估胚胎發(fā)育。
[0023] 任選地，提高胚胎分析方法的靈敏度的方法還包括評估在囊胚期和超過囊胚期 (原腸胚形成期）的胚胎標(biāo)志物的表達(dá)。所述評估可包括測定報(bào)告基因的熒光。所述分析 方法可檢測培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)物質(zhì)中的胚胎毒性。一方面，所述分析方法檢測培養(yǎng)基的功 能性和在臨床體外受精環(huán)境中使用的物質(zhì)的適用性。
[0024] 本發(fā)明公開了包括可操作地連接至至少一個胚胎多能性調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)區(qū)域的至 少一個轉(zhuǎn)基因的改良的轉(zhuǎn)基因胚胎。所述胚胎多能性調(diào)節(jié)子包括這些調(diào)節(jié)子的基因以及在 確保正常胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的它們的上游介導(dǎo)物和下游效應(yīng)子。有利地，所述轉(zhuǎn)基因是 報(bào)告基因。所述報(bào)告基因可以是熒光或發(fā)光蛋白，例如，綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，藍(lán)綠 色熒光蛋白，桔色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
【附圖說明】
[0025] 專利文件或申請文件包括至少一個彩色附圖。帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?公開的副本根據(jù)請求并在支付了所需的費(fèi)用的條件下由專利局提供。
[0026] 圖2表示在最優(yōu)或次優(yōu)生長條件下0CT-4的表達(dá)。圖2A是在最優(yōu)生長條件下孵 育的小鼠胚胎的彩色照片。圖2B是在次優(yōu)生長條件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。胚胎 生長至囊胚期，隨后由DAPI (藍(lán)色，核染色）和抗-0CT-3/4抗體（紅色）染色。所述胚胎 通過熒光顯微鏡顯像。
[0027] 圖3表示在最優(yōu)或次優(yōu)生長條件下S0X2的表達(dá)。圖3A是在最優(yōu)生長條件下孵 育的小鼠胚胎的彩色照片。圖3B是在次優(yōu)生長條件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。圖3C 是在次優(yōu)生長條件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。胚胎生長至囊胚期，由DAPI (藍(lán)色）和 抗-S0X2抗體（綠色）染色，隨后在熒光顯微鏡下拍攝照片。
[0028] 圖4是在最優(yōu)生長條件下孵育至囊胚期的小鼠胚胎的彩色照片。所述胚胎由 DAPI (藍(lán)色）和抗-⑶X-2抗體（綠色）染色，隨后在熒光顯微鏡下拍攝照片。
[0029] 圖5顯示基于使用光學(xué)顯微鏡的形態(tài)分析的培養(yǎng)了 48小