一種安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原及其快速檢驗(yàn)裝置及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原及其快 速檢驗(yàn)裝置及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 安乃近(dipyrone)，屬于吡唑酮類(lèi)解熱鎮(zhèn)痛藥，是臨床常用的熱鎮(zhèn)痛藥之一。安乃 近在體內(nèi)可迅速水解成活性產(chǎn)物4-甲基氨基安替比林，產(chǎn)生藥理作用，4-甲基氨基安替比 林在體內(nèi)代謝為4-甲酰胺基安替比林和4-氨基安替比林。由于安乃近解熱效果確切，在許 多國(guó)家都被廣泛使用，投入臨床應(yīng)用已有百年歷史。但由于該藥導(dǎo)致粒細(xì)胞減少，再生障礙 性貧血，嚴(yán)重的過(guò)敏和休克虛脫等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，世界上一些發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)做出了停止 或限制使用安乃近的規(guī)定，如美國(guó)、瑞典禁止該藥用于食源性動(dòng)物中，歐盟對(duì)食源性動(dòng)物組 織中安乃近限量的要求為l〇〇yg/kg(以安乃近代謝物含量計(jì)算），我國(guó)對(duì)安乃近在食源性動(dòng) 物組織中的限量為200yg/kg。
[0003] 在獸醫(yī)領(lǐng)域，安乃近主要作為一些嚴(yán)重疾病的輔助對(duì)癥藥物。由于其解熱鎮(zhèn)痛療 效確切，價(jià)廉易得，經(jīng)常被長(zhǎng)期過(guò)量使用，且由于不嚴(yán)格遵守休藥期等原因，容易在動(dòng)物體 內(nèi)產(chǎn)生積蓄殘留，進(jìn)而危害人類(lèi)的生命健康。
[0004] 目前，檢測(cè)安乃近代謝物殘留的方法主要有:分光光度法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光光度 法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。分光光度法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā) 光光度法和薄層色譜法具有測(cè)定速度快、樣品通量大和檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但容易受基質(zhì) 中與目標(biāo)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的化合物的干擾而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。高效液相色譜法 與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更好的準(zhǔn)確性、靈敏度和重復(fù)性。但都需要儀器，有的還很昂 貴，耗時(shí)也較長(zhǎng)，前處理復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作與維護(hù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原及其快速檢驗(yàn) 裝置及其制備方法，針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)安乃近技術(shù)的不足，建立一種檢測(cè)安乃近殘留的快速方 法，使其能更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)安乃近殘留，滿(mǎn)足了安乃近代謝物殘留快速檢測(cè)的 需要，給食品安全提供重要手段。
[0006] 對(duì)此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原，其具有式(1)所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：
[0008] p
[0009] 上述化學(xué)結(jié)構(gòu)式的化學(xué)名為丨，5-二甲基-3-羰基-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-氨基）乙酸;其分子量為261，其MS母離子峰為261.7:其熔點(diǎn)為115-122°C。
[0010] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原采用以下步驟制備得 到：
[0011]步驟S1:將4-氨基安替比林與溴乙酸丁酯在堿性催化劑的作用下，于100-110°C下 反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物;其中，所述堿性催化劑優(yōu)選為碳酸鉀。
[0012] 步驟S2:在中間產(chǎn)物中加入三氟乙酸，在pH值為6.5~7.5下反應(yīng)得到如式⑴所示 的結(jié)構(gòu)式的安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原。
[0013] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟A的反應(yīng)在溶劑中進(jìn)行，所述溶劑為二甲基甲 酰胺。
[0014] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟B的反應(yīng)在二氯甲烷溶劑進(jìn)行。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選的，采用如下反應(yīng)路線(xiàn)制備安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原：
[0016]
[0017] 制備所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原的步驟為：
[0018] (1)在4-氨基安替比林(反應(yīng)物1)中，加入碳酸鉀與二甲基甲酰胺(DMF)，105°C下 攪拌lOmin后，加入5g溴乙酸丁酯（反應(yīng)物2)，攪拌過(guò)夜后，將混合物減壓蒸干，用水洗滌后 用乙酸乙酯萃取，再次蒸干后，過(guò)硅膠柱純化后再次蒸干得到中間產(chǎn)物1。
[0019] (2)向中間產(chǎn)物1中加入二氯甲烷和三氟乙酸（TFA)，攪拌3~5h，蒸干溶劑，加入 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5~7.5后，用乙酸乙酯反復(fù)萃取，蒸干即得到4-氨基安替比林衍生物， 即安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原。
[0020] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種安乃近代謝物檢測(cè)用抗原，采用如上所述的安乃近代謝物檢 測(cè)用半抗原制備得到，將所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原與BSA溶于pH值為9.0的碳酸緩沖 溶液，并加入碳二亞胺，攪拌12~24h，透析純化，得到安乃近代謝物檢測(cè)用抗原4-氨基安替 比林衍生物-BSA;即利用碳二亞胺法，將所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原與載體蛋白牛血 清偶聯(lián)，得到4-氨基安替比林衍生物-BSA，即所述安乃近代謝物檢測(cè)用抗原。
[0021] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體，采用如上所述的安乃近代 謝物檢測(cè)用抗原4-氨基安替比林衍生物-BSA與免疫Balb/c小鼠經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌 抗4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用獲得的雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹 水，純化后獲得安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體。
[0022] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置，包括反應(yīng)杯和檢測(cè)試紙，所 述檢測(cè)試紙包括襯板以及襯板上依次粘附包被膜、吸水墊、樣品墊，并使得樣品墊、吸水墊 分別位于包被膜的兩側(cè);所述反應(yīng)杯里含有如上所述安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體標(biāo)記 的膠體金，所述包被膜上噴涂有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)采用如上所述的安乃近代謝 物檢測(cè)用抗原溶液噴制。
[0023] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述檢測(cè)區(qū)包括直線(xiàn)式隱形檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)，所述質(zhì)控區(qū)包 括羊抗鼠IgG溶液噴制的直線(xiàn)式隱形控制線(xiàn)C線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)和控制線(xiàn)C線(xiàn)相互平行。
[0024] 本發(fā)明還公開(kāi)了一種如上所述的安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置的制備方法，其包 括以下步驟：
[0025] 步驟A:安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原及抗原的制備；
[0026] 將4-氨基安替比林與溴乙酸丁酯在碳酸鉀催化劑的作用下，于100_110°C下反應(yīng)， 得到中間產(chǎn)物;在中間產(chǎn)物中加入三氟乙酸，在pH值為6.5~7.5下反應(yīng)得到所述安乃近代 謝物檢測(cè)用半抗原;利用碳二亞胺法將所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原與載體蛋白牛血清 偶聯(lián)，制備得到所述安乃近代謝物檢測(cè)用抗原；
[0027] 步驟B:安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體的制備；
[0028]用4-氨基安替比林衍生物-牛血清蛋白抗原與免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選 得到分泌抗4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用獲得的細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生 腹水，純化后獲得4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體；
[0029] 步驟C:膠體金標(biāo)記安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體制備金標(biāo)抗體，膠體金的制 備；
[0030] 用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金;將膠體金與所述安乃近代謝物檢測(cè)用單 克隆抗體混合形成金標(biāo)抗體，離心復(fù)溶后得到安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體標(biāo)記的膠體 金；
[0031 ]步驟D:膠體金反應(yīng)杯、纖維膜的包被；
[0032]將步驟C得到的安乃近代謝物檢測(cè)用單克隆抗體標(biāo)記的膠體金分裝至微孔反應(yīng)杯 中，低溫干燥;將所述安乃近代謝物檢測(cè)用抗原與羊抗鼠IgG分別噴涂在纖維膜的檢測(cè)線(xiàn)和 控制線(xiàn)區(qū)域，干燥得到包被膜；
[0033]步驟E:試紙條的組裝；
[0034] 將包被膜、吸水墊和樣品墊依次在粘附在襯板上組裝得到所述安乃近檢測(cè)試紙。
[0035] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置的制備方法還包 括將粘好的所述安乃近檢測(cè)試紙切成等寬度的試紙條，將所述反應(yīng)杯及試紙條密封干燥保 存。優(yōu)選的，采用鋁箱袋密封保存。
[0036] 本發(fā)明的技術(shù)方案，采用膠體金免疫層析方法檢測(cè)安乃近代謝物提供了一種快 速、簡(jiǎn)便的安乃近檢測(cè)方法，這是一種利用膠體金標(biāo)記單克隆抗體，利用抗原抗體的特異性 結(jié)合判斷待測(cè)樣品中被檢測(cè)物質(zhì)的含量。其制備方法包括4-氨基安替比林衍生物半抗原及 其抗原的制備，4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體的制備，檸檬酸三鈉法制備膠體金，在適 當(dāng)?shù)臉?biāo)記條件下標(biāo)記4-氨基安替比林衍生物單克隆抗體得到金標(biāo)抗體，然后離心純化金標(biāo) 抗體，接著將純化好的金標(biāo)抗體分裝至微孔反應(yīng)杯里，冷凍干燥，同時(shí)將包被抗原4-氨基安 替比林衍生物-牛血清蛋白抗原、二抗羊抗小鼠IgG包被在纖維膜上，將干燥好的纖維膜，吸 水墊，樣品墊依次有序粘貼在硬質(zhì)襯板上，制備膠體金試紙條。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
[0038] 第一，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，能 更加快速、靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)安乃近代謝物的殘留。
[0039]第二，本發(fā)明的技術(shù)方案的快速檢驗(yàn)裝置，具有特異性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限 達(dá)到150pbb，檢測(cè)快速，只需lOmin可完成檢驗(yàn)，前處理簡(jiǎn)單。
[0040]第三，采用本發(fā)明技術(shù)方案的快速檢驗(yàn)裝置，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好;不需 要任何儀器設(shè)備，便于攜帶，檢測(cè)成本低;試紙條使用簡(jiǎn)單，無(wú)需專(zhuān)業(yè)人士操作;試紙條儲(chǔ)存 方便，穩(wěn)定性好，在室溫下至少可以保存六個(gè)月。
【附圖說(shuō)明】
[0041 ]圖1是本發(fā)明一種實(shí)施例安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置的組裝結(jié)構(gòu)示意圖。圖中， 1為底板，2為檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)，3為控制線(xiàn)C線(xiàn)，4為樣品墊，5為包被的硝酸纖維膜，6為吸水墊，7為 層析方向，8為反應(yīng)杯。
[0042]圖2是本發(fā)明一種實(shí)施例安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置組裝好后的結(jié)構(gòu)示意圖。 [0043]圖3是本發(fā)明所述安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原的MS譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的較優(yōu)的實(shí)施例作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 如圖1和圖2所示，一種安乃近代謝物的快速檢驗(yàn)裝置，其包括反應(yīng)杯8(即為金標(biāo) 微孔)和檢測(cè)試紙，所述檢測(cè)試紙包括底板1以及底板1上一端粘附的樣品墊4,中間粘附的 包被的硝酸纖維膜5,另一端端粘附的吸水墊6。其中，反應(yīng)杯8中含有抗4-氨基安替比林衍 生物-膠體金標(biāo)記物，包被的硝酸纖維膜5上包被了 4-氨基安替比林衍生物-BSA抗原和羊抗 鼠IgG，檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)2、控制線(xiàn)C線(xiàn)3位于包被的硝酸纖維膜5上，其中，所述檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)采用的安 乃近代謝物檢測(cè)用抗原溶液噴制，為直線(xiàn)式隱形的檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)2;所述控制線(xiàn)C線(xiàn)3采用羊抗 鼠IgG溶液噴制，為直線(xiàn)式隱形的控制線(xiàn)C線(xiàn)3,檢測(cè)線(xiàn)T線(xiàn)2和控制線(xiàn)C線(xiàn)3相互平行。在檢測(cè) 時(shí)，待測(cè)樣品溶液按照從樣品墊4向另一端的層析方向7進(jìn)行層析。其中，所述底板1為PVC襯 板。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 該試紙條的制備方法包括的步驟如下：
[0049] 步驟A:安乃近代謝物檢測(cè)用半抗原4-氨基安替比林衍生物及其抗原的制備：
[0050] 按照如下式(2)的合成路線(xiàn)合成所述4-氨基安替比林衍生物。
[00511先稱(chēng)取4g4-氨基安替比林，即式(2)中的反應(yīng)物1，加入2g碳酸鉀與30