0°C后繼續(xù)攪拌1小時(shí)，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完 成，展開(kāi)劑為石油醚:乙酸乙酯=10:1，得到中間產(chǎn)物（II)。
[0022] (2)稱(chēng)取2.8g經(jīng)三乙胺堿化的3-叔丁氧羰基氨基丙胺，溶于10mL二氯甲烷中，在冰 浴條件下加入到上述中間產(chǎn)物（II)反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攪拌過(guò)夜；依次用 50mL水和飽和食鹽水各洗滌2次；用無(wú)水硫酸鈉干燥后，過(guò)濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真空旋干 后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到中間產(chǎn)物（111)2.38g，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體 積比為12:1，收率為65%。
[0023] (3)稱(chēng)取步驟2得到的半抗原中間產(chǎn)物（III) 1.82g溶于5mL1，4-二氧六環(huán)中，冰浴 下加入15mL鹽酸二氧六環(huán)，室溫反應(yīng)4小時(shí)后將析出固體用30mL石油醚洗滌3次，再以石油 醚混合固體，經(jīng)真空旋干除去水分，得到終產(chǎn)物（IV)0.61g，收率為67%。咕匪R(500MHz, DMS0-d6) 57.95 (br, 3H), 7.84 (t,J= 6.0Hz, 1H), 7.01 (d,J= 7.0Hz, 1H), 6.86 (d,J= 8.0Hz, 1H), 6.75 (t,J= 8.0Hz, 7.0Hz, 1H), 3.12 (m, 2H), 3.03 (s， 2H), 2.82 (m， 2H), 1.76 (m， 2H), 1.40 (s， 6H)〇
[0024]實(shí)施例2克百威人工抗原的制備。
[0025] (1)稱(chēng)取21mg半抗原和牛血清白蛋白67mg溶解在5mLPBS緩沖液中，室溫磁力攪拌 下至充分溶解后，避光反應(yīng)并逐滴加入25%的戊二醛溶液14ul，溫和攪拌反應(yīng)30分鐘后，向 反應(yīng)液中加入硼氫化鈉溶液至終濃度為10mg/mL，然后4°C避光反應(yīng)2小時(shí)，即得到人工抗原 混合液。
[0026] (2)將人工抗原混合液移入處理過(guò)的透析袋中，用0.01M的PBS緩沖液在4°C磁力 攪拌下透析2天，再用去離子水透析1天，每天更換3次透析液;透析結(jié)束后離心取上清，使用 凍干法將其制成粉末，即得到克百威人工抗原:CAR-BSA。
[0027]實(shí)施例3克百威抗血清的制備。
[0028]用實(shí)施例2制備的人工抗原作為免疫原，與弗氏完全佐劑等量混合，乳化完全后 選取2月齡的健康雌性新西蘭大白兔于頸背部皮下多點(diǎn)注射，每間隔3周加強(qiáng)免疫一次。四 免后第7天耳緣靜脈采血，離心得到抗血清。
[0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的克百威人工抗原免疫兔子得到的抗血清，四免效價(jià) 可達(dá)128000,對(duì)克百威具有良好的選擇性識(shí)別能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種克百威氨基化半抗原的合成方法，其特征是以呋喃酚為原料，通過(guò)酯化、胺解及 Boc保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng)，最終合成克百威氨基化半抗原，具體合成路線如下：本發(fā)明目標(biāo)化合物的合成方法分為以下步驟： (1) 取一定量的呋喃酚溶于50mL二氯甲烷(DCM)中，冰浴下加入三乙胺(Et3N)，攪拌10 分鐘后，將二(對(duì)硝基苯)碳酸酯溶于15mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，控制反 應(yīng)摩爾比為呋喃酚:二(對(duì)硝基苯)碳酸酯=1:1;逐漸升溫至30°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1小時(shí)，TLC 板監(jiān)控反應(yīng)完成，展開(kāi)劑為石油醚:乙酸乙酯=10:1，合成中間產(chǎn)物（II); (2) 稱(chēng)取一定量經(jīng)三乙胺堿化的3-叔丁氧羰基氨基丙胺（與呋喃酚摩爾比為1:1)，溶 于10mL二氯甲烷中，在冰浴條件下加入到上述反應(yīng)液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攪拌過(guò)夜； 依次用50mL水和飽和食鹽水各洗滌2次；用無(wú)水硫酸鈉干燥后，過(guò)濾除去干燥劑，濾液經(jīng)真 空旋干后經(jīng)200-300目硅膠柱層析純化得到中間產(chǎn)物（III)，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯，體 積比為12:1，收率為65%; (3) 將步驟2得到的半抗原中間產(chǎn)物（III)溶于5mL 1，4_二氧六環(huán)中，冰浴下加入15mL 鹽酸二氧六環(huán)，室溫反應(yīng)4小時(shí)后將析出固體用30mL石油醚洗滌3次，再以石油醚混合固體， 經(jīng)真空旋干除去水分，得到終產(chǎn)物(IV)，收率為67%。2. -種克百威人工抗原，其特征在于:是在權(quán)利要求1中所述的氨基化半抗原式（IV)的 氨基基團(tuán)上偶聯(lián)載體蛋白得到的分子，其合成步驟為： (1) 稱(chēng)取一定量的半抗原和牛血清白蛋白（BSA)溶解在5mL磷酸鹽緩沖液中（PBS，0.01 M，pH 7.4)，室溫磁力攪拌下至充分溶解后，避光反應(yīng)并逐滴加入25%的戊二醛(GA)溶液，控 制反應(yīng)摩爾比半抗原:戊二醛:BSA=40~80: 35 :1，溫和攪拌反應(yīng)30分鐘后，向反應(yīng)液中加入 硼氫化鈉溶液至終濃度為10mg/mL，然后4°C避光反應(yīng)2小時(shí)，即得到人工抗原混合液； (2) 將人工抗原混合液移入處理過(guò)的透析袋中，用0.01M的PBS緩沖液在4°C磁力攪拌 下透析2天，再用去離子水透析1天，每天更換3次透析液;透析結(jié)束后離心取上清，使用凍干 法將其制成粉末，即得到克百威人工抗原:CAR-BSA。3.用權(quán)利要求1所述方法合成的克百威半抗原的應(yīng)用，其特征在于農(nóng)產(chǎn)品中克百威農(nóng) 藥殘留的免疫方法檢測(cè)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明“一種克百威氨基化半抗原的合成方法及應(yīng)用”，涉及生物化工技術(shù)。本發(fā)明是新型的克百威氨基化半抗原合成方法，合成步驟簡(jiǎn)潔有效，得率高，避免了克百威羧基化半抗原制備中傳統(tǒng)三光氣合成方法大量使用光氣和甲苯的危害性。以呋喃酚為起始原料，通過(guò)酯化及胺解、Boc保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng)，引入一條含3個(gè)碳和氨基端的手臂鏈，形成氨基化半抗原。采用戊二醛法使半抗原和載體蛋白上的氨基進(jìn)行縮合，最大程度暴露克百威抗原決定簇，免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明制備的人工抗原具有良好免疫原性。本發(fā)明的半抗原及人工抗原可完全用于克百威免疫分析中，滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)對(duì)克百威殘留的檢測(cè)需要，應(yīng)用前景廣闊。
【IPC分類(lèi)】G01N33/531, C07K14/765, C07D307/79
【公開(kāi)號(hào)】CN105439997
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510781611
【發(fā)明人】孫鳳霞, 彭夏雨, 羅小玲, 盧春霞, 羅瑞峰, 王靜, 謝勇, 黨富民, 康立超
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)墾科學(xué)院, 孫鳳霞
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年11月13日