從大豆中提取葉酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物提取物的制備，具體地涉及一種大豆種子的提取和含量的測定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸是水溶性B維生素，葉酸缺乏會(huì)引起嬰兒神經(jīng)管缺陷、癌癥和心血管疾病等嚴(yán) 重的健康問題（Kimetal.，1998;Geisel，2003;Choi&Friso,2005;Ma;risaetal. ,2005)。 人類和動(dòng)物不能自身合成葉酸，各種作物是人類和動(dòng)物獲取這一維生素的主要來源。然而， 在作物中葉酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何獲得作物中各種葉酸衍生 物含量的可靠數(shù)據(jù)是這一研究領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。作物中葉酸的提取，常用的有單酶法和三 酶法。單酶法針對(duì)菠菜、黃瓜、卷心菜和香蕉等食物中的葉酸提取有效（Iwatanietal.， 2003;Zhangetal.，2005)。三酶法對(duì)谷物類，土豆，豆類等的葉酸含量的提取效率高于單 酶法，三酶法相對(duì)于單酶法能夠更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基質(zhì)的葉酸（De Souza&Eitenmiller，1990;Tamuraetal，1997;Pffeiferetal，1997;Raderetal, 1998 ;Ais〇&Tamura，1998)dyun等（2005)研究的食物葉酸提取步驟，適量樣品在提取液中 研磨成勻漿，勻漿液分裝后凍存于_70°C直至葉酸提取，加入蛋白酶處理樣品后，100°C煮沸 樣品滅活蛋白酶，再利用α-淀粉酶和葉酸輒合酶共同孵育樣品2小時(shí)，經(jīng)離心后獲取葉酸樣 品，與-7 0 °C凍存樣品。但是不同食物中使用的三酶法提取條件是不同的（Aisο&Tamura， 1998;Pandrangietal. ,2004)，有必要對(duì)每種類型食物分別進(jìn)行葉酸提取的優(yōu)化。
[0003]目前國內(nèi)國際流行的作物中葉酸含量檢測方法是微生物法和高效液相色譜法。高 效液相色譜法利用C18色譜柱進(jìn)行樣品分離后，結(jié)合紫外吸收，熒光檢測和電化學(xué)檢測能夠 對(duì)單個(gè)葉酸組分進(jìn)行定量分析。高效液相色譜法能夠快速、高效地分離不同葉酸衍生物，樣 品用量少，但是該方法的靈敏度低于微生物法，而且內(nèi)源葉酸會(huì)干擾葉酸測定，給某些形式 的葉酸定量帶來困難（Zhangetal.，2005;P0o_Prietoetal· ,2006)。微生物法 (MicrobiologicalAssay)是檢測葉酸的經(jīng)典方法，其原理是指示菌對(duì)葉酸的所有衍生物 具有相同的生長反應(yīng)速度，在一定條件下，微生物的生長繁殖與培養(yǎng)基中葉酸含量呈正比 關(guān)系，根據(jù)微生物對(duì)樣品中葉酸的吸收程度從而對(duì)葉酸進(jìn)行定量(常娜寧等，2010)。酪乳酸 桿菌對(duì)單谷氨酸葉酸、二或三谷氨酸葉酸及其還原型衍生物均敏感，是最為常用的菌種 (Hyunetal. ,2005)。葉酸分析中要求不同樣品具有適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，使用96孔酶標(biāo)板對(duì) 指示菌進(jìn)行18-24h培養(yǎng)，并在分光光度計(jì)讀取數(shù)值后計(jì)算樣品中葉酸的含量。微生物法靈 敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，但重復(fù)性較差，而且只能檢測總?cè)~酸含量，但優(yōu)點(diǎn)是不需要貴重的儀器 或藥品，所以成本較低，適用于大批量的樣品檢測。
[0004] 綜上，有必要對(duì)大豆葉酸三酶法提取和微生物檢測的方法進(jìn)行優(yōu)化，確定三種酶 的最佳配比和微生物法檢測的步驟，為篩選高葉酸含量的大豆優(yōu)異種質(zhì)提供科學(xué)的依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種大豆種子 葉酸的提取和含量檢測方法，旨在建立三酶法提取及微生物檢測大豆種子中葉酸含量的方 法，為篩選高葉酸含量的大豆優(yōu)異種質(zhì)提供科學(xué)的依據(jù)。
[0006]本發(fā)明用到的材料和儀器如下：
[0007]一、材料和試劑
[0008] 常規(guī)藥品為國產(chǎn)分析純試劑；磷酸緩沖液(AMERES⑶公司生產(chǎn)）；葉酸（Sigma公 司）;α-淀粉酶(來源于米曲霉)和蛋白酶(來源于鏈霉素）（Sigma公司）；大鼠血清（中科晨宇 (北京)貿(mào)易有限公司）；乳酸菌液體培養(yǎng)基和葉酸培養(yǎng)基購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司； 乳酸菌菌株購自北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司；
[0009]二、儀器與設(shè)備
[001 0]AXYGEN系列EP管（自經(jīng)科宏達(dá)公司）；葉酸檢測試劑盒(P1001)購自德國拜發(fā)生物 有限公司；高通量組織研磨機(jī)SPEXGeno2000(美國SPEX公司生產(chǎn)）；3-30K高速臺(tái)式冷凍離 心機(jī)（德國SIGMA);酶標(biāo)儀（美國DynexMagellanBiosciences)。
[0011] 本發(fā)明提供了一種大豆種子葉酸的提取方法，包括以下步驟：
[0012] (1)大豆樣品制備：大豆種子粉碎獲取豆粉，稱取0.2g豆粉，置于AXYGENEP管中， 在樣品中加入750yL葉酸提取緩沖液，95°C孵育15min置于冰上冷卻，加入5mm鋼珠(2粒），在 組織研磨機(jī)中研磨樣品，獲得樣品勻漿液；
[0013] (2)大豆葉酸提取:在步驟（1)樣品勻漿液中加入8yLa-淀粉酶和750yL葉酸提取緩 沖液以避免粘稠，室溫放置lOmin，加入100yL蛋白酶，37°C孵育lh;100°C煮沸l(wèi)Omin，冰上迅 速冷卻1〇111；[11;在4°0，14000印1]1條件下，離心1〇1]1；[11 ;吸取上清，按照2%的體積比在上清中加 入大鼠血清10yL，混勻后，于37°C培養(yǎng)2h;100°C煮沸滅活10min，冰上迅速冷卻lOmin;在4 °C，14000rpm條件下，離心15min;吸取上清分裝于滅菌管中直接測定或凍存于-80°C，得大 豆葉酸提取液。
[0014]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例大豆種子葉酸的提取方法還可以具有如下附加的技 術(shù)特征：
[0015] 所述大豆樣品制備步驟一中所述在組織研磨機(jī)中研磨的轉(zhuǎn)速為1400rpm，時(shí)間為 5min。所述大豆樣品制備步驟一中所述研磨均需在避光條件下操作，大豆葉酸提取步驟均 需在避光條件下操作。
[0016]所述大豆樣品制備步驟二中所述緩沖液的組分為pH值6.5的50mM磷酸緩沖液，加 入1 %的抗壞血酸鈉鹽，以及0.1 %的2-巰基乙醇。
[0017]本發(fā)明的第二個(gè)目的，是提供了一種大豆種子葉酸含量的測定方法，包括以下步 驟：
[0018]一、乳酸菌液體培養(yǎng)基的配制：將4.85g乳酸菌液體培養(yǎng)基加入100mL水中，121°C滅菌15min;
[0019]二、低葉酸培養(yǎng)基的配制：稱取4.7g葉酸培養(yǎng)基粉末、0.03g抗環(huán)血酸、0.3mL葉酸 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)配液，加水溶解定容至100mL，過0.22μπι濾膜滅菌備用；
[0020]三、分析緩沖液的配制：稱取Na2HP〇4.2H20 0.388、恥!^〇4〇.938、抗環(huán)血酸18加水 溶解定容至100mL，過0.22μπι濾膜滅菌備用；
[0021 ]四、葉酸培養(yǎng)基的配制：稱取葉酸培養(yǎng)基粉末9.4g，加水溶解定容至100mL，煮沸 5min，過0.22μηι濾膜滅菌備用；
[0022] 五、葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制備:稱取28mg葉酸溶于4mL5%的1(冊04溶液中，然后用分析緩 沖液定容至250mL，再吸取0.5mL此溶液用步驟三制得的分析緩沖液定容至100mL，得濃度為 0.5yg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液FA，分裝到1.5mLEP管中并保存于-20°C;
[0023] 六、指示菌的制備：吸取乳酸菌保存菌液500yL加入到10mL乳酸菌液體培養(yǎng)基中， 37°C搖床培養(yǎng)24h，再次吸取培養(yǎng)好的菌液0.5mL加入到100mL低葉酸培養(yǎng)基中，37°C搖床培 養(yǎng)18h;三角瓶置于冰上冷卻20min;將預(yù)冷的甘油與培養(yǎng)物混合(體積比為40:60)，充分?jǐn)?拌均勻;分裝菌液于1.5mLEP管中，液氮速凍后于-80°C保存；
[0024]七、葉酸含量測定:利用步驟一制得的分析緩沖液將步驟五制得的FA溶液稀釋250 倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析緩沖液稀釋，得到FA-2溶液;FA-1和FA-2溶液均用 于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;將葉酸樣品短暫離心，用分析緩沖液稀釋樣品30倍;在96孔板中，將150yL 分析緩沖液加入每個(gè)樣品孔后，再將150yLFA-1、FA-2和大豆葉酸待測液分別加入96孔板 的第1列，從第1列吸取混合液150μ1至第2列，在從第2列吸取混合液150μ1至第3列，再從第3 列吸取混合液150μ1至第4列，在從第4列吸取混合液150μ1至第5列，再從第5列吸取混合液 150μ1至第6列，最后將第6列的樣品混合液棄去其中150μ1;將加入指示菌的FACM培養(yǎng)基150 yL加入96孔板中；將培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)18-20h;在波長為580nm條件下，測定樣品的0D值； 根據(jù)測定數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣品中包含的葉酸濃度。
[0025]本發(fā)明的技術(shù)效果在于：
[0026] 1、本發(fā)明采用的樣品研磨方法來替代手動(dòng)磨樣或攪拌機(jī)研磨方法，可以同時(shí)對(duì)上 百個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行提取，在高效完成提取過程的同時(shí)減少了試驗(yàn)誤差。
[0027] 2、本發(fā)明選取可來源于米曲霉的α_淀粉酶及來自鏈霉菌的蛋白酶和大鼠血清來 提取大豆中的葉酸。
[0028] 3、本發(fā)明確定了α-淀粉酶、蛋白酶和大鼠血清的組合在8yL，100yL及10yL的條件 下能夠最大程度地提取大豆種子中的葉酸。
[0029] 4、本發(fā)明確定了微生物法測定葉酸含量的方法:將葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品用分析緩沖液稀 釋250倍，得到FA-1溶液，按照2:1比例利用分析緩沖液稀釋，得到FA-2溶液;FA-1和FA-2溶 液均用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線;將葉酸樣品短暫離心，用分析緩沖液稀釋樣品30倍;在96孔板中， 將150yL分析緩沖液加入每個(gè)樣品孔后，再將15