一種制備高純度米爾貝肟的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物制藥領(lǐng)域，涉及一種動(dòng)物用抗生素的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種制 備高純度米爾貝肟的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 米爾貝廂（milbemycinoxime)是一種新型的半合成的大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲藥物，是米 爾貝霉素A3和A4的肟化衍生物，對(duì)控制和預(yù)防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通 常用來預(yù)防惡絲蟲病，控制線蟲、鉤蟲引發(fā)的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。
[0003] 米爾貝A3肟和米爾貝A4肟的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
[0005]目前米爾貝肟主要是通過發(fā)酵得到的米爾貝霉素半合成來得到，但是米爾貝霉素 發(fā)酵液?jiǎn)挝黄毡椴桓?，產(chǎn)品的含量較低，組份雜質(zhì)多，分離困難。這給制備高純度的米爾貝 肟帶來了很大的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的高純度米爾貝肟的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的制備高純度米爾貝肟的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進(jìn)行固液分離，然后用第 一溶媒萃取菌渣，得到含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的提取液；
[0009] 2)將提取液濃縮后上硅膠柱層析，并用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液進(jìn)行洗 脫，得到含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的解吸液；
[0010] 3)將解吸液濃縮，去除溶劑，然后用二氯甲烷溶解濃縮物并進(jìn)行氧化反應(yīng)，得到含 有米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；
[0011] 4)將步驟3)得到的溶液經(jīng)活性炭吸附脫色后進(jìn)行濃縮，濃縮物用第一溶媒溶解， 上硅膠柱層析，用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液進(jìn)行洗脫，得到含有米爾貝霉素A3酮和 米爾貝霉素A4酮組份的解吸液，然后濃縮結(jié)晶，分離出結(jié)晶體；
[0012] 5)對(duì)結(jié)晶體進(jìn)行肟化反應(yīng)，加入水終止反應(yīng)后加入二氯甲烷萃取，得到含有米爾 貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的二氯甲烷溶液；
[0013] 6)將上述的含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的二氯甲烷溶液去除溶劑， 用第三溶媒的水溶液溶解，進(jìn)行樹脂層析，然后將解吸液按照米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉 素A4肟含量比例為1:4進(jìn)行混合，得到解吸混合液；
[0014] 7)用庚烷萃取解吸混合液，得到含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的庚烷 溶液，然后去除溶劑，再用第三溶媒溶解，加水降溫進(jìn)行結(jié)晶，固液分離、干燥得到米爾貝肟 晶體。
[0015] 上述步驟1)的發(fā)酵液是通過現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行菌種發(fā)酵培養(yǎng)得到的含有米爾貝霉素 A3和A4組份的發(fā)酵液；所述第一溶媒可以是庚烷或甲苯，優(yōu)選庚烷；萃取溶媒用量?jī)?yōu)選為 菌渣重量的8~10倍；萃取溫度以30~40°C為宜。
[0016] 上述步驟2)將提取液濃縮至米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的濃度為10~ 15g/L，并通過除菌板除菌后再上硅膠柱；其中所述除菌板的孔徑為0. 2~0. 45μm;所使用 的硅膠為工業(yè)級(jí)層析硅膠，粒徑為100~400目，干硅膠粉末的使用重量?jī)?yōu)選為米爾貝霉素 A3和米爾貝霉素A4組份凈含量重量的50~100倍；所述第二溶媒可以是丙酮或丁酮，優(yōu) 選丙酮；第一溶媒和第二溶媒混合的比例優(yōu)選為第一溶媒體積（V):第二溶媒體積（V)= 80:20 ~95:5〇
[0017]上述步驟3)氧化反應(yīng)使用的氧化劑可以是活性二氧化錳、氯鉻酸吡啶鹽（PCC)、 重鉻酸吡啶鹽（roc)等；更優(yōu)選活性二氧化錳。
[0018] 上述步驟4)中使用的活性炭?jī)?yōu)選針用活性炭；活性炭的加入量為米爾貝霉素A3 酮和米爾貝霉素A4酮總量的2~3倍（質(zhì)量）；活性炭加入后保持二氯甲烷溶液的溫度范 圍為30~35°C攪拌1~2小時(shí)，然后通過除菌板去除活性炭粉末，得到澄清的含有米爾貝 霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮的二氯甲烷溶液。將澄清的含有米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮的二氯甲烷溶液濃縮去除溶劑后，用第一溶媒溶解，上硅膠柱層析，所述硅膠為 工業(yè)級(jí)層析硅膠，粒徑為100~400目，干硅膠粉末的使用量為米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮組份重量的50~100倍；洗脫所用的混合溶媒中第一溶媒體積（V):第二溶媒 體積（V) = 5:1 ~11:1。
[0019] 上述步驟5)肟化反應(yīng)可以是：將米爾貝霉素酮結(jié)晶體用無水乙醇完全溶解后， 將鹽酸羥胺的水溶液緩慢加入該米爾貝霉素酮乙醇溶液中，攪拌混合同時(shí)保持溶液溫度為 20~25°C，反應(yīng)1小時(shí)以上，直到米爾貝霉素酮完全轉(zhuǎn)變成米爾貝霉素肟后終止反應(yīng)。
[0020] 上述步驟6)中所述第三溶媒優(yōu)選為乙醇或甲醇，更優(yōu)選甲醇；樹脂層析所使用的 上柱液為第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的體積百分含量為55%~60%;樹脂層析所使 用的解吸液也是第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的體積百分含量為60%~70%且高于 上柱液的含量；所使用的樹脂優(yōu)選為苯乙烯-聚苯乙烯系列的非極性大孔樹脂。
[0021] 上述步驟7)先在解吸混合液中加入兩倍解吸混合液體積的水，再用庚烷進(jìn)行萃 取，得到含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的庚烷溶液；然后將上述庚烷溶液去除溶 劑后加入第三溶媒進(jìn)行溶解，得到米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟總濃度為20g/L~ 50g/L的溶液；再緩慢加入體積為第三溶媒體積3~4倍的水，降低溶液溫度到10~20°C， 緩慢攪拌結(jié)晶；最后固液分離、真空干燥得到含高純度米爾貝肟的結(jié)晶體。
[0022] 本發(fā)明提供了一種較簡(jiǎn)單的純化方式得到高純度的米爾貝肟，非常適用于工業(yè)化 大生產(chǎn)。組份我們?cè)谘芯窟^程中驚喜的發(fā)現(xiàn)通米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的混合 物，在使用氧化活性較低的氧化劑氧化后，通過一次硅膠層析，米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮的含量輕松的由不到25%提高到了 75%以上，且在氧化酮解吸液的濃縮過程中 米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮會(huì)自然析出結(jié)晶，產(chǎn)品的含量再次上升到95%以上，通 過樹脂層析調(diào)整米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的含量比例的同時(shí)能夠再次將產(chǎn)品的 含量提高到98%以上。整個(gè)工藝比較簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求較低，通用性好，無需太大的改造，可 以快速進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本 領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明 的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0024] 下列實(shí)施例中，為了方便描述，將米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4產(chǎn)品之和稱為 "米爾貝霉素組份";將米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮產(chǎn)品之和稱為"米爾貝酮組份"； 將米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟產(chǎn)品之和稱為"米爾貝肟組份"。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 對(duì)含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進(jìn)行板框壓濾，菌渣用8倍 菌渣重量的甲苯萃取，得到的甲苯萃取液經(jīng)過高壓液色譜相檢測(cè)計(jì)算含米爾貝霉素組份 100g。濃縮甲苯萃取液，直到甲苯中米爾貝霉素組份的含量為15g/L，甲苯萃取濃縮液通過 0. 45μm孔徑的除菌板過濾。
[0027] 過濾后的甲苯萃取液進(jìn)行硅膠上柱。硅膠柱由5kg的干硅膠裝填而成，硅膠粒徑 為100~200目。上柱完成后用甲苯：丙酮=95:5(V/V)的解吸液對(duì)硅膠柱進(jìn)行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米爾貝霉素組份90g，取小部分解吸液濃縮干，通過高壓液相 色譜檢測(cè)計(jì)算米爾貝霉素組份在濃縮物中的質(zhì)量含量為20 %。
[0028] 將米爾貝霉素組份的解吸液減壓濃縮干，回收溶劑，濃縮物用二氯甲烷溶解，投入 活性二氧化錳氧化，直到高壓液相色譜檢測(cè)所有米爾貝霉素組份氧化成米爾貝酮組份后將 二氯甲烷中的活性二氧化錳過濾去除。得到二氯甲烷溶液含米爾貝酮組份86g。向二氯甲 烷溶液投入針用活性炭258g，水浴35°C下攪拌2小時(shí)，通過除菌板過濾去除活性炭。過濾 后的二氯甲烷米爾貝酮組份溶液，濃縮干回收二氯甲烷后用甲苯溶解濃縮物。
[0029] 用8. 6kg重量的干硅膠在甲苯中浸泡后裝填層析柱。含有米爾貝酮組份的甲苯溶 液上柱后，用甲苯：丙酮=11:1(V/V)的解吸液對(duì)硅膠柱進(jìn)行解吸，收集含有米爾貝酮組 份的解吸液，得到含有米爾貝酮組份76g的解吸液混合液。濃縮解吸液過程中結(jié)晶，離心機(jī) 分離結(jié)晶體68g，高壓液相色譜檢測(cè)后計(jì)算其中含米爾貝酮組份65g。
[0030] 將米爾貝酮結(jié)晶體用1760mL無水乙醇溶解，稱取163. 2g鹽酸羥胺用163mL純化 水溶解完全，將鹽酸羥胺水溶液緩慢加入米爾貝酮乙醇溶液中，攪拌并保持溶液20°C，加入 完1小時(shí)后取樣，用高壓液相色譜檢測(cè)，米爾貝酮反應(yīng)完全，立即加入水終止反應(yīng)，并用二 氯甲烷萃取，得到含有米爾貝肟組份的二氯甲烷溶液，通過高壓液相色譜檢測(cè)計(jì)算二氯甲 烷溶液中含有米爾貝肟63g。
[0031] 濃縮干二氯甲烷溶液，用甲醇溶液溶解濃縮物，再向其中緩慢加入水，使其甲醇的 體積百分比降低為60%，用上海華震色譜-3樹脂進(jìn)行層析，上柱完成后用甲醇的體積百分 比為70%的甲醇水溶液進(jìn)行解析，收集含有米爾貝肟的解吸液，通過高壓液相色譜檢測(cè)調(diào) 整混合解吸液中米爾貝霉素A3肟色譜含量和米爾貝霉素A4肟組份色譜含量比例=1: 4。 解吸液中加入2倍解吸液體積的水，并用庚烷萃取，通過高壓液相色譜檢測(cè)計(jì)算庚烷溶液 中含有米爾貝肟組份50g
[0032] 濃縮干并回收庚烷，用2. 5L甲醇溶解濃縮物，再向其中緩慢加入10L純化水，降低 溫度到20C結(jié)晶。
[0033] 離心分離結(jié)晶物，真空干燥得到米爾貝肟結(jié)晶體48g，通過高壓液相色譜檢測(cè)其中 米爾貝肟組份質(zhì)量百分含量為98. 3%。
[0034] 實(shí)施例2
[0035] 對(duì)含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進(jìn)行板框壓濾，菌渣用10 倍菌渣重量的庚烷萃取，得到的庚烷萃取液經(jīng)過高壓液相色譜檢測(cè)計(jì)算含米爾貝霉素組份 120g。濃縮庚烷萃取液，直到庚烷中米爾貝霉素組份的含量為10g/L，庚烷萃取濃縮液通過 0.2μπι孔徑的除菌板過濾。
[0036] 過濾后的庚烷萃取液進(jìn)行硅膠上柱。硅膠柱由12kg的干硅膠裝填而成，硅膠粒徑 為300~400目。上柱完成后用庚烷：丁酮= 80:20 (V/V)的解吸液對(duì)硅膠柱進(jìn)行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米爾貝霉