一種油茶粕中黃酮苷的快速制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于功能成分提取技術領域，具體涉及一種油茶柏中黃酮苷的快速制備方法。
【背景技術】
黃酮類化合物廣泛存在于植物界，是一類重要的多酚類天然產(chǎn)物，是植物代謝過程中產(chǎn)生的一類重要天然有機化合物。黃酮類化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗發(fā)炎、血管舒張和抗菌等作用，多年來一直是國內外研究開發(fā)的熱點。油茶籽榨油后的渣滓(俗稱油茶柏)中含有豐富的三萜類植物皂苷-茶皂素，還含有其他黃酮、鞣質等生物活性物質。對于廢棄物油茶柏中提取純化黃酮的研究還比較少，經(jīng)初步分析，油茶柏中黃酮主要為山奈酚糖苷類黃酮。
[0002]對于油茶柏黃酮的分離純化多采用反復硅膠柱層析法，中壓柱層析法，制備型高效液相色譜，高速逆流色譜分離純化等進行分離純化;陳虹霞等(陳虹霞，王成章，葉建中，周昊.油茶餅柏中黃酮苷類化合物的分離與結構鑒定[J].林產(chǎn)化學與工業(yè)，2011年2月，第31卷第I期)采用茶籽餅柏經(jīng)過乙醇水溶液提取，浸膏采用甲醇溶解并冷凍后去除不溶物，通過中低壓色譜制備得到黃酮苷類化合物，再進一步通過高效液相制備得到黃酮苷化合物
I和Π ;專利CN201010229218.6公開了一種中壓柱快速分離油茶餅柏中黃酮苷的制備方法，其采用中壓柱層析加高效液相色譜制備得到純度95%以上的黃酮苷單體兩個;然而以上方法具有得率低，溶劑用量大，需反復進行和使用專業(yè)設備如中壓柱，制備型高效液相色譜法，條件局限，步驟繁多，專業(yè)性強，技術難于掌握，分離量小等問題。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的就在于為解決現(xiàn)有技術的不足而提供一種操作步驟簡單、不需要大型精密儀器的油茶柏中黃酮苷的快速制備方法。
[0004]本發(fā)明的目的是以下述技術方案實現(xiàn)的:
一種油茶柏中黃酮苷的快速制備方法，包括以下步驟:
(1)采用乙醇提取油茶柏總黃酮;得到油茶柏總黃酮提取物；
(2)大孔吸附樹脂純化:采用弱極性大孔吸附樹脂動態(tài)吸附富集，15-45%乙醇動態(tài)洗脫;洗脫液濃縮后得到純度大于85%的總黃酮；
(3)低壓柱精制:采用低壓硅膠層析柱，常壓條件下，以乙酸乙酯:甲醇:水為洗脫液，乙酸乙酯:甲醇:水(V: V: V) = (170-230): (25-45): (8_12);得到純度大于89.3%的化合物I和純度大于92.5%的化合物II;化合物I為山奈酚3-0-[2-0-13-D-木糖-6-0-a-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(I);化合物II為山奈酚3-0-[2-0-13_D-半乳糖-6-0-a-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷(Π)ο
[0005]步驟(3)得到的化合物I經(jīng)重復步驟(3)，純度達到95%以上。
[0006]步驟(3)得到的化合物II經(jīng)在甲醇中結晶，純度達到98%以上。
[0007]步驟(I)具體為:采用體積比例為50-95%乙醇，提取溫度40_70°C，提取液固比為(5-15): l(ml:g)，提取次數(shù)1-4次，每次提取1-3 h，提取液減壓濃縮回收乙醇，得到油茶柏黃酮粗提物。
[0008]步驟(2)大孔吸附樹脂型號HZ816，顆粒度0.3-1.2。
[0009]步驟(2)具體為:將步驟(I)得到的油茶柏黃酮粗提物加水配制成濃度為3-8mg/mL的油茶柏黃酮粗提液，上柱量為6-1IBV(柱體積)，上柱流速為0.8-1.5 BV/h;洗脫流速為0.8-1.5BV/h，洗脫液體積為3-5BV;洗脫液減壓濃縮，采用冷凍干燥得到樣品純度大于85%的總黃酮。
[0010]步驟(3)硅膠目數(shù)為100-300目。
[0011]步驟(3)具體為:將步驟(2)得到的經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的總黃酮加甲醇溶解，上樣量為總黃酮:硅膠(g/g)=( 0.8-1.2): 4，洗脫液流速為0.6-1.0 BV/h。
[0012]大孔樹脂是一類具有大孔結構的高分子吸附劑，理化性質穩(wěn)定。它具有良好的大孔網(wǎng)狀結構和較大的比表面積，可以通過物理吸附及離子交換吸附從溶液中有選擇地吸附有機物。油茶柏醇提液中含有多糖、鞣質。蛋白質等雜質，必須對其進行分離純化。油茶柏中黃酮屬于極性化合物，且具有較好的水溶性，而且容易和大孔樹脂形成氫鍵，有利于樹脂的吸附。為了達到既能除掉雜質又能提高黃酮純度的目的選擇大孔吸附樹脂進行富集純化。
[0013]經(jīng)大孔吸附樹脂富集純化后的油茶柏黃酮主要是黃酮類化合物的混合物，為探索油茶柏中的化學成分，進一步研究油茶柏中黃酮類化合物的生物活性成分，開拓其醫(yī)藥方面的應用范圍，提高油茶的綜合開發(fā)利用價值，有必要對其進行進一步的精制。
[0014]硅膠柱層析采用硅膠為介質，利用樣品中各組分與硅膠間吸附力的不同，對組分進行分離。對于分離到的黃酮單體借助于紅外、質譜、核磁共振等儀器進行結構鑒定，為其在醫(yī)藥方面的進一步應用提供依據(jù)。
[0015]本發(fā)明首先通過乙醇提取獲得油茶柏總黃酮粗提物，再經(jīng)過大孔吸附樹脂富集純化、低壓柱層析精制，就能分離到油茶柏黃酮單體。不需要大型精密設備，操作步驟簡單，易掌握，尤其方法簡單穩(wěn)定性重復性強，且得率高，有效成分損失小，能有效的對油茶柏中活性成分黃酮單體進行分離，將為進一步放大實驗和工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。為油茶餅柏中黃酮苷藥物和保健功能產(chǎn)品開發(fā)提供了優(yōu)質原料。
【附圖說明】
[0016]圖1是油茶柏中乙醇提取液HPLC圖譜；
圖2是大孔吸附樹脂純化后黃酮HPLC圖譜；
圖3是化合物IHPLC圖譜；
圖4是化合物Π HPLC圖譜；
圖5是化合物I的紅外光譜圖；
圖6是化合物I的質譜圖；
圖7是化合物I的lH-NMR(DMS0-d6中)；
圖8是化合物I的lC-NMR(DMS0-d6中)；
圖9是化合物Π紅外光譜圖；
圖10是化合物Π質譜圖； 圖11是化合物Π H-NMR(DMS0-d6中)；
圖12是化合物Π H-NHKD2O*);
圖13是化合物Π 13C-NMIKD2O中)。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
一種油茶柏中黃酮苷的快速制備方法，包括以下步驟:
(1)米用乙醇提取油茶柏總黃酮;米用體積比例為50-95%乙醇，提取溫度40-70°C、提取液固比為(5-15): l(ml:g)，提取次數(shù)1-4次，每次提取1-3 h，提取在攪拌條件下進行，攪拌速率為100轉每分鐘，提取液減壓濃縮回收乙醇，得到油茶柏黃酮粗提物；
(2)大孔吸附樹純化:將步驟(I)得到的油茶柏黃酮粗提物加水配制成濃度為3-8mg/mL的油茶柏黃酮粗提液，采用弱極性大孔吸附樹脂型號HZ816，顆粒度0.3-1.2，進行動態(tài)吸附富集純化，玻璃層析柱規(guī)格Φ 1.0 X 50 cm，15-45%乙醇動態(tài)洗脫；上柱量為6-1IBV(柱體積)，流速為0.8-1.5 BV/h;洗脫流速為0.8-1.5BV/h，洗脫液體積為3-5BV;洗脫液減壓脫醇濃縮，采用冷凍干燥得到樣品純度大于85%的總黃酮；
(3)低壓柱精制:將步驟(2)得到的經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的總黃酮，加入少量甲醇溶解進行低壓硅膠層析柱，以100-300目的硅膠濕法裝柱分離純化，以乙酸乙酯:甲醇:水為洗脫液，分部收集洗脫液，化合物I先流出，化合物Π后流出，合并相同流分;采用低壓玻璃層析柱(Φ 1.6 X 50 cm)，上樣量為總黃酮:娃膠(g/g) = (0.8-l.2): 4，常壓條件下，乙酸乙酯:甲醇:水(V: V: V) = ( 170-230): (25-45 ):(8-12),洗脫液流速為 0.6-1.0BV/h;按此條件精制的黃酮中化合物I和化合物Π產(chǎn)品，純度分別達89.3%和92.5%以上，化合物I和化合物Π的回收率分別達到73.5%和73.1%?；衔颕經(jīng)重復硅膠柱層析，純度達到95%以上，化合物Π在甲醇中結晶純度達到98%以上，此純度樣品進行后續(xù)的結構鑒定?；衔颕為山奈酚3-0-[2_Ο-β-D-木糖-6-0-a-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷和化合物Π為山奈酚3-0-[2-0-13-D-半乳糖-6-0-a-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。
[0018]實施例2
一種油茶柏中黃酮苷的快速制備方法，包括以下步驟:
(1)采用乙醇提取油茶柏總黃酮;采用體積比例為95%乙醇，提取溫度60°C、提取液固比為10:1，提取次數(shù)2次，每次提取2 h，提取在攪拌條件下進行，攪拌速率為100轉每分鐘，提取液減壓濃縮回收乙醇，得到油茶柏黃酮粗提物；
(2)大孔吸附樹純化:將步驟(I)得到的油茶柏黃酮粗提物加水配制成濃度為5mg/mL的油茶柏黃酮粗提液，采用大孔吸附樹脂型號HZ816，顆粒度0.3-1.2，進行動態(tài)吸附富集純化，玻璃層析柱規(guī)格Φ 1.0X50 cm, 25-35%乙醇動態(tài)洗脫;上柱量為10.5BV(柱體積)，流速為1.0 BV/h;洗脫流速為1.0 BV/h，洗脫液體積為4BV;洗脫液減壓脫醇濃縮，采用冷凍干燥得到樣品純度大于85%的總黃酮；
(3)低壓柱精制:將步驟(2)得到的經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的總黃酮，加入少量甲醇溶解進行低壓硅膠柱層析，以100-300目的硅膠濕法裝柱分離純化，常壓條件下，以乙酸乙酯:甲醇:水為洗脫液，分部收集洗脫液;采用低壓玻璃層析柱(Φ 1.6 X 50 cm)，上樣量為Ig總黃酮/45g硅膠，乙酸乙酯:甲醇:水