茄子隱花色素基因SmCRY2及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及茄子光信號通路中的關(guān)鍵酶及其編碼基因，具體 涉及一種茄子隱花色素基因 SmCRY2及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)光和近紫外光可以使植物產(chǎn)生藍(lán)光反應(yīng)，隱花色素在植物中的主要作用就是作 為藍(lán)光和近紫外光的受體，來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。在擬南芥中存在3個隱花色素基因 CRY1，CRY2和CRY3,其中研究比較多的主要是CRY1和CRY2XRY1和CRY2蛋白在藍(lán)光照射條件 下發(fā)生磷酸化，這種磷酸化是特異的依賴于藍(lán)光并隨著藍(lán)光光強(qiáng)的增強(qiáng)而增加，而紅光和 遠(yuǎn)紅光并沒有這種效果。CRY1和CRY2蛋白的磷酸化和其功能發(fā)揮也是密切相關(guān)的，篩選到 的CRY1和CRY2功能缺失的cryl和cry2突變體中，有多數(shù)是因為突變位點(diǎn)干擾了CRY蛋白的 磷酸化。
[0003] 對隱花色素 CRY2生理功能的了解主要是通過分析其功能缺失突變體cry2實現(xiàn)的， 對其表型分析顯示，cry2突變體在高光強(qiáng)藍(lán)光下其下胚軸長度與野生型差別不大，但在弱 藍(lán)光條件下，cry2突變體的下胚軸長度比野生型的稍長。另外，cry2單突變體的子葉面積比 野生型的小，說明CRY2參與了子葉面積擴(kuò)展的調(diào)控。cry2突變體另外一個顯著的表型就是 表現(xiàn)為開花時間的延遲，暗示了 CRY2參與到了光周期開花過程的調(diào)控。
[0004]目前已從很多植物中克隆得到CRY基因，如擬南芥、大豆、玉米、番茄等。茄子是重 要的蔬菜作物，但相關(guān)研究相對比較滯后。目前，未有任何與茄子CRY2基因及其編碼蛋白的 相關(guān)文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)茄子CRY2基因的空白，提供一種茄子CRY2的cDNA以及氨基 酸序列;進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了茄子SmCRY2基因在不同組織器官的表達(dá)模式。本發(fā)明還提 供了SmCRY2轉(zhuǎn)入擬南芥后表型發(fā)生改變的結(jié)果。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明涉及一種茄子CRY2蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0008] 第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼茄子CRY2蛋白的SmCRY2基因，所述SmCRY2基因的 cDNA序列包括：
[0009] (a)如SEQ ID NO. 1第1~1944位所示的堿基序列；或
[0010] (b)與SEQ ID NO. 1第1~1944位所示的堿基序列具有至少70%的同源性的堿基序 列;或
[0011] (C)能與SEQ ID NO. 1第1~1944位所示的堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列。
[0012] 優(yōu)選的，所述cDNA序列包括SEQ ID NO.1第1~1944位所示的核酸序列中1~90個 核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個以內(nèi)核苷酸。
[0013] 第三方面，本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增SmCRY2基因的引物對，所述引物對的堿基序 列如SEQIDN0·3、SEQIDN0·4所示。
[0014] 第四方面，本發(fā)明涉及一種SmCRY2基因在植物組織中表達(dá)量的定量分析方法，所 述方法包括如下步驟：
[0015] S1、獲得植物組織，提取其總RNA;
[0016] S2、以所述總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;
[00Π ] S3、以cDNA第一條鏈為模板，分別用SmCRY2基因與內(nèi)參基因 Actin(⑶984779.1)的 特異性引物擴(kuò)增進(jìn)行熒光定量分析，獲得所述SmCRY2基因在植物組織中表達(dá)量；
[0018] 所述擴(kuò)增SmCRY2基因的特異性引物的堿基序列如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6所 示;所述擴(kuò)增內(nèi)參基因 Actin(⑶984779.1)的堿基序列如SEQIDN0.7、SEQIDN0.8所示。 [0019 ]第五方面，本發(fā)明涉及一種SmCRY2基因在在基因工程改良植物品質(zhì)中的用途。
[0020] 優(yōu)選的，所述基因工程改良植物品質(zhì)指的是基因工程改良植物在弱光中生長不 良。
[0021] 優(yōu)選的，所述植物包括擬南芥、大豆、玉米或番茄。
[0022] 在本發(fā)明中，術(shù)語"SmCRY2基因編碼序列"指SEQ ID N0.1所示的第1~1944位核苷 酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 1所示的第1~1944位核苷酸中，有 一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的 簡并性，所以與SEQ ID NO. 1所示的第1~1944位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列 也能編碼出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0023]該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的茄子SmCRY2相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1所 示序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個以內(nèi)核苷酸。
[0024] 在本發(fā)明中，可用實時熒光定量PCR的方法分析茄子SmCRY2基因產(chǎn)物的表達(dá)模式， 即分析茄子SmCRY2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
[0025] 此外，根據(jù)本發(fā)明的茄子SmCRY2核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或 表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選茄子SmCRY2相關(guān)同源基因或同源蛋白。
[0026] 為了得到與茄子SmCRY2相關(guān)基因的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選茄子cDNA文庫，這些 探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對茄子SmCRY2相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。適 合于篩選的cDNA文庫是來自茄子的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方 法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自 Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal ·。這種篩選方法可以識別與前子SmCRY2相關(guān)的基因 家族的核苷酸序列。
[0027] 本發(fā)明的茄子SmCRY2相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組 法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其 是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所 制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR 擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0028] 當(dāng)獲得了有關(guān)序列后，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其 克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0029] 此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0030] 光信號能調(diào)控許多次生代謝途徑，例如花青素的合成。茄子是廣泛種植的蔬菜作 物，紫色茄子的果皮含有豐富的花青素。近年來的研究結(jié)果表明，紫色茄子的抗氧化保健作 用在常見蔬菜作物中是最好的。因此，本發(fā)明針對目前茄子研究基礎(chǔ)薄弱的現(xiàn)狀，克隆藍(lán)光 受體SmCRY2基因，為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì)，獲得具有高抗氧化性的藥物或 食物提供理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0031] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯；
[0032] 圖1為本發(fā)明的茄子CRY2蛋白與番茄CRY2蛋白的氨基酸序列同源比較(FASTA)結(jié) 果;其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出；
[0033] 圖2為本發(fā)明的茄子CRY2基因在不同組織的表達(dá)情況；
[0034] 圖3為轉(zhuǎn)SmCRY2基因植株的RT-PCR檢測；
[0035]圖4為轉(zhuǎn)SmCRY2基因?qū)M南芥突變株cry2-l的表型恢復(fù)情況；
[0036]圖5為轉(zhuǎn)SmCRY2基因?qū)M南芥突變株crv2_l的開花情況的影響。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所 述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0038] 實施例1、茄子SmCRY2基因的克隆
[0039] 1.植物材料的獲得
[0040]本實驗所用的植物材料為茄子優(yōu)良種質(zhì)資源藍(lán)山禾線茄。實驗材料栽培于上海市 閔行區(qū)浦江鎮(zhèn)航天育種基地的人工塑料大棚中。在自然條件下育苗，生長并結(jié)實。采集茄子 的葉片用于提取RNA。
[0041 ] 2.RNA 的提取
[0042] 采用TRIzol法提取總RNA(TRIzol購自生工生物工程(上海）股份有限公司）。用甲 醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計(Thermo Scientific NAN0DR0P 1000 Spectrophotometer)上測定RNA的純度及濃度。
[0043] 3.基因的全長克隆
[0044] 基于Genbank中CRY2基因的保守序列設(shè)計一對簡并引物。將提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 (Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit:寶生物工程（大連）有限公司），以第 一鏈cDNA為模板，利用引物
[0045] FI (SEQ ID ^.3):57 -ATGGAGAKSAAYTMCAAGACWATTGT-37
[0046] R1(SEQ ID N0.4)：57-TCATCSYRTYGTAGYTTCAYTTTTGC-37
[0047] 進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到預(yù)期長度后回收并連接到pMD-19T(