地特胰島素或其類似物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及胰島素類似物的制備方法，尤其涉及由人雙鏈胰島素前體desB30的 B29位賴氨酸的ε-氨基選擇性酰化生成地特胰島素或其類似物的方法，屬于胰島素類似物 的制備領域。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，其基本病理特征 為絕對或相對性胰島素分泌不足所引起的代謝紊亂。糖尿病已成為繼心腦血管疾病、惡性 腫瘤后的第三大威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，尤其是它所帶來的視網(wǎng)膜病變、周圍 神經(jīng)病變、糖尿病腎病等并發(fā)癥嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。
[0003] 胰島素及其類似物是最直接和最有效的糖尿病治療藥物，中國胰島素市場潛力巨 大。地特胰島素 （Insulin detemir)是一種中性、可溶的長效胰島素。它是原型胰島素去除 了 B鏈第30位蘇氨酸，通過?；饔迷贐29位賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基結(jié)合一個14碳的直鏈脂肪酸 而成，是一種胰島素類似物。?；闹舅峥煞€(wěn)定胰島素分子的自身聚集，且與白蛋白可逆 性結(jié)合，使地特胰島素從皮下注射部位吸收緩慢，作用持續(xù)時間延長，在控制血糖的同時能 減少低血糖的風險。
[0004] 由于胰島素原、胰島素或胰島素類似物都具有位于Α1、Β1位置氨基酸的游離α-氨 基與Β29位賴氨酸側(cè)鏈上的游離ε-氨基，這三種游離氨基均可與活性酯、酰鹵或酸酐形成共 價鍵，從而形成單?；葝u素、雙?；葝u素甚至三酰化產(chǎn)物。從諾和諾德申請的多項專利 中公開的?；肪€，首先利用二碳酸二叔丁酯(B0C)衍生保護胰島素兩條鏈的Ν末端α-氨 基，再利用肉豆蔻酸琥珀酰亞胺酯?；?9位賴氨酸的ε-氨基，最后利用TFA脫保護，生成地 特胰島素。如果?；瘎┻^量會生成大量的二取代或者三取代衍生物，因此該工藝步驟繁瑣、 副產(chǎn)物多，會增加下游純化的難度，同時不利于整體收率的提高。ε -氨基選擇性?；瘜＠?(中國專利CN1171742Α)中采用一步選擇性?；?，在pH 10.5的堿性條件下，利用優(yōu)選活化酯 (棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯)進行?；磻嵝詶l件終止反應，該方法雖然在一定程度上 提升了酰化效率，其最終的?；嗜匀徊桓?，距規(guī)模化的工業(yè)應用尚有一定的距離，有待 改進。
[0005] 現(xiàn)有由胰島素前體通過?；磻苽涞靥匾葝u素或其類似物的方法中不同程度 的存在?；实汀⒏碑a(chǎn)物多、成本高等缺點。因此，開發(fā)一種新的可產(chǎn)業(yè)化的酰化效率高、 副產(chǎn)物少，生產(chǎn)成本低的地特胰島素或其類似物的高效制備方法，將為工業(yè)化應用奠定重 要的基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種地特胰島素或其類似物的制備方法，該方 法將B鏈第30位缺少蘇氨酸的人雙鏈胰島素前體desB30,在未保護desB30蛋白雙鏈N末端α-氨基的條件下，利用活化酯一步選擇性地?；?9位賴氨酸的ε-氨基，從而生成地特胰島素 或其類似物。本發(fā)明方法的選擇性?；哂行矢?、?；磻獣r間短、副產(chǎn)物少等優(yōu)點。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0008] 本發(fā)明首先公開了一種地特胰島素或其類似物的制備方法，包括以下步驟：（1)將 人雙鏈胰島素前體desB30溶解于水相緩沖液中，得到desB30前體溶液，調(diào)節(jié)desB30前體溶 液的pH值，然后加入有機相，混勻得到混合溶液；（2)向混合溶液中加入活化酯溶液，進行選 擇性?；磻?；（3)終止反應，分離純化，即得;其中，步驟（1)調(diào)節(jié)desB30前體溶液的pH值至 8.0-11.0;優(yōu)選的，步驟(1)調(diào)節(jié)desB30前體溶液的pH值至9.0-9.5，更優(yōu)選為9.0。
[0009] 步驟(2)所述活化酯溶液是將活化酯溶解于有機相中，使活化酯的濃度為8_12mg/ ml，優(yōu)選為10mg/ml (活化酯溶液要現(xiàn)配現(xiàn)用）。
[0010] 步驟(2)所述選擇性地?；磻?，活化酯與人雙鏈胰島素前體desB30的摩爾比 為4:1-1:4,優(yōu)選為2:1-1:2,更優(yōu)選為1:1。其中，所述活化酯選自肉豆蔻酸丁二酰亞胺酯、 棕櫚酸N-琥珀酰亞胺基酯、辛酸N-琥珀酰亞胺基酯中的任意一種;所述有機相選自乙腈、甲 醇或乙醇中的任意一種，優(yōu)選為乙醇。
[0011] 步驟(2)所述選擇性地?；磻窃谖幢Ｗo人雙鏈胰島素前體desB30蛋白雙鏈N 末端α_氨基的條件下，利用活化酯酰化人雙鏈胰島素前體desB30的B29位賴氨酸的ε-氨基； 其中，當活化酯為肉豆蔻酸丁二酰亞胺酯時，人雙鏈胰島素前體desB30經(jīng)一步選擇性酰化， 得到的目的產(chǎn)物是地特胰島素。
[0012] 本發(fā)明所述制備方法中，步驟(2)所述選擇性?；磻臅r間為15-60min，優(yōu)選為 25-60min，更優(yōu)選為25-45min。所述選擇性?；磻臏囟葹槭覝?，即15-30°C，優(yōu)選為25 〇C。
[0013] 步驟(1)所述水相緩沖液為磷酸氫二鈉緩沖液;優(yōu)選的，所述磷酸氫二鈉緩沖液的 濃度為50-120mmol/L，pH值為2-4;更優(yōu)選的，所述磷酸氫二鈉緩沖液的濃度為100mmol/L， pH值為3 〇
[0014]步驟（1)所述desB30前體溶液中，人雙鏈胰島素前體desB30的終濃度為4-8mg/ml， 優(yōu)選為6mg/ml。步驟（1)所述有機相的體積是混合溶液總體積的30-50%，優(yōu)選為40% ;其 中，所述有機相選自乙腈、甲醇或乙醇中的任意一種，優(yōu)選為乙醇。
[0015] 本發(fā)明所述制備方法中，步驟(3)所述終止反應為調(diào)節(jié)反應液的pH值至6.5-7.5， 優(yōu)選為7.0。本發(fā)明加入lmo 1 /L HC1調(diào)節(jié)反應液的pH值。
[0016] -步酰化反應首先需氨基去質(zhì)子化，其次?；墓w需要較高的活化能。本發(fā)明 中當desB30前體溶液的pH在8-11的范圍內(nèi)，優(yōu)選pH為9,使胰島素前體在水溶液中ε-氨基處 于未離子化，而α_氨基則被重新離子化的狀態(tài)。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，desB30前體溶液的pH 值在8-11之間都可以發(fā)生?；磻?其中pH值偏8的條件下，易產(chǎn)生A1，B1位單?；a(chǎn)物;而 pH為9.0與9.5的?；磻a(chǎn)率較高，pH 9.0的?；磻a(chǎn)率為81.7%，pH 9.5的?；磻?產(chǎn)率為73% ;根據(jù)統(tǒng)計學顯著性差異計算，p = 0.00021〈0.05，說明pH 9.0與pH 9.5的酰化 反應產(chǎn)率具有顯著性差異。因此，本發(fā)明中desB30前體溶液的pH優(yōu)選9.0。
[0017] 本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，活化酯與desB30的摩爾比在4:卜1:4之間都可以發(fā)生酰化反應;活 化酯與desB30的摩爾比在2:1-1:2之間時?；磻a(chǎn)率達70%-87.2%?；罨ゼ尤肓可?， 會導致desB30有未?；模换罨ゼ尤肓窟^高，會導致產(chǎn)生大量的二?；Ｒ虼?，最優(yōu)選為 活化酯與desB30的摩爾比為1: 1，?；磻a(chǎn)率達到87.2%，達到優(yōu)化的條件下還可減少成 本。
[0018] 本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)選的條件下，?；磻M行25min即可達到86.8%的酰 化率，時間繼續(xù)加長，對?；实挠绊懖淮?，酰化反應45min的?；蕿?6%、60min的?；?率為85.7%。
[0019] 本發(fā)明通過將人雙鏈胰島素前體desB30在不同的緩沖液下溶解然后與活化酯進 行?；磻Y(jié)果表明，磷酸氫二鈉的效果比硼酸好，因為硼酸溶液存在下會產(chǎn)生一個較大 脫氨雜峰，影響酰化率。因此，本發(fā)明的水相緩沖液優(yōu)選為磷酸氫二鈉緩沖液。
[0020] 本發(fā)明技術方案與現(xiàn)有技術相比，具有以下有益效果：
[0021] 本發(fā)明建立了一種采用活化酯一步選擇性?；葝u素前體desB30的B29位賴氨酸 側(cè)鏈ε_氨基轉(zhuǎn)化成地特胰島素或其類似物的方法。利用該方法酰化目的產(chǎn)物的得