用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的地衣芽孢桿菌制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)微生態(tài)菌劑領(lǐng)域，特別是涉及一種應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的 地衣芽孢桿菌制劑及應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模化、集約化及精養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，池塘中的殘餌、排泄物及其它有 機(jī)污染物也日趨增多，有機(jī)污染物分解需要大量消耗溶氧，同時產(chǎn)生大量的有毒有害物質(zhì)， 如氨氮，亞硝酸鹽，硫化物等。隨著這些有毒有害物質(zhì)增加，不僅影響水產(chǎn)動物的生長、繁 殖，嚴(yán)重的甚至產(chǎn)生中毒死亡。而水體中病原微生物的數(shù)量與水體中氨氮、亞硝酸鹽、硫化 物的濃度直接相關(guān)，如淡水魚類細(xì)菌性敗血癥的發(fā)病條件之一是水體惡化，氨氮、亞硝酸鹽 明顯偏高。因此，如何有效地調(diào)控養(yǎng)殖水體的水質(zhì)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一個關(guān)鍵問題。
[0003] 地衣芽孢桿菌因?yàn)榫哂蟹€(wěn)定性好、抗性強(qiáng)、耐高溫、耐酸堿，富產(chǎn)淀粉酶，蛋白酶， 抑制病原菌繁殖，促進(jìn)動物營養(yǎng)的消化吸收，分解有機(jī)污染物，凈化水質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng) 用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中。
[0004] 為了能夠利于生產(chǎn)，運(yùn)輸，我們生產(chǎn)產(chǎn)品中的芽孢菌主要是以孢子的狀態(tài)存在，但 其應(yīng)用于水體或水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)，都需要的主要是營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞，因此，在水產(chǎn)上使用芽孢 桿菌制劑，在使用前會經(jīng)過活化，即使芽孢狀態(tài)的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞，但傳統(tǒng)上的 活化主要是加入一些紅糖，或葡萄糖，培養(yǎng)基之類的營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)其生長繁殖，如芽孢桿菌 制劑:紅糖:水以1:1:10的比例進(jìn)行"活化"，但傳統(tǒng)上的"活化"存在以下幾個方面的問題： 一是高營養(yǎng)培養(yǎng)基加水后易使空氣與水中的酵母菌，乳酸菌繁殖迅速，消耗培養(yǎng)基中 營養(yǎng)，迅速降低培養(yǎng)液中PH，抑制芽孢的萌發(fā)與生長； 二是芽孢萌發(fā)前期需要時間長，一般需要4小時，芽孢才會開始萌發(fā)，而此時，由于"活 化"液中酵母菌與乳酸菌的大量繁殖導(dǎo)致PH下降迅速，已經(jīng)可以抑制芽孢的萌發(fā)與繁殖，從 而大大影響芽孢萌發(fā)； 三是高營養(yǎng)培養(yǎng)基中也易感染大腸桿菌，真菌等有害雜菌，導(dǎo)致施用后效果差仍致有 反作用； 四是芽孢菌用量大，效果不穩(wěn)定。
[0005] 然而到目前為止還沒有公開過有關(guān)一種應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵擴(kuò)繁的能夠 較好控制雜菌與促進(jìn)地衣芽孢快速萌發(fā)的地衣芽孢桿菌制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵擴(kuò)繁的能 夠較好控制雜菌與促進(jìn)芽孢快速萌發(fā)的地衣芽孢桿菌菌劑及其應(yīng)用方法，具體說是提供一 種可應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵擴(kuò)繁，利用納他霉素抑制病原真菌，酵母菌等真菌與，利用 多粘桿菌素抑制大腸桿菌，沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的生長，利用肌苷，果糖，絲氨酸等芽 孢萌發(fā)劑，能快速促進(jìn)地衣芽孢的萌發(fā)，提高芽孢萌發(fā)效率，減少芽孢萌發(fā)時間，從而快速 使用地衣芽孢桿菌能在簡易的發(fā)酵條件下，水與空氣未經(jīng)過滅菌的條件下，快速繁殖而占 據(jù)優(yōu)勢菌種，而更好的抑制其他的雜菌與有害菌，從而得到一種活菌含量高，活性好，雜菌 低的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的地 衣芽孢桿菌制劑，制備該地衣芽孢桿菌制劑的原料為:地衣芽孢桿菌菌粉50-200份，硫酸粘 桿菌素5_50份，納他霉素1_6份，肌苷20-100份，玉米粉50-200份，玉米衆(zhòng)粉50-200份，氯化 鈉50-200份，絲氨酸20-100份，果糖20-50份，紅糖50-200份。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的地衣芽孢桿菌制劑的制備方法包 括以下步驟： 0)、地衣芽孢桿菌菌粉的制備 取出地衣芽孢桿菌菌種保藏管，用LB固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30°C培養(yǎng)48小時。在 平板下挑取單個菌落接種50毫升LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中30°C震蕩培養(yǎng)24小時。種子采用 5%的接種量，接種至5L大三角瓶中，裝液量為2L的LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)20-28小時，檢測 其菌液濃度，活菌含量超過20億CFU/ mL，即可作為地衣芽孢桿菌液體菌種接種至1000L發(fā) 酵培養(yǎng)基，接種量為5%，開攪拌120r/min，每分鐘通氣量為液/氣1:0.8，37°C培養(yǎng)16-24小 時，待芽孢含量不低于60億CFU/ mL，即可結(jié)束發(fā)酵，板框過濾除水，剩下菌體加輕質(zhì)碳酸 鈣，調(diào)節(jié)菌濃度為100億CFU/g，粉碎過100目即得到地衣芽孢桿菌菌粉。其中所述LB培養(yǎng)基： 蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，水1 OOOmL，pH7.2，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2%。其中，所述發(fā) 酵培養(yǎng)基:葡萄糖l〇g/L，玉米粉20 g/L，玉米漿粉10 g/L，豆柏粉20 g/L，硫酸鎂0.5 g/L， 硫酸錳0.5 g/L，磷酸二氫鈉0.5 g/L，磷酸氫二鈉2.3 g/L，pH7.2。各培養(yǎng)基滅菌的條件為： 0 · 10-0 · 15MPa，121°C 滅菌 30 分鐘； ③、混合，包裝 將硫酸粘桿菌素5-50份，納他霉素1-6份，肌苷20-100份，可溶性淀粉50-200份，干玉米 漿50-200份，氯化鈉50-200份，絲氨酸20-100份，果糖20-50份，紅糖50-200份，放置密封攪 拌罐中攪拌20-30分鐘，混合均勻，再將步驟Φ制備的地衣芽孢桿菌菌粉50-200份加入攪拌 罐中攪拌均勻后，分裝500克/包，真空包裝，即得到用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的地衣芽孢桿 菌制劑； 該地衣芽孢桿菌制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場現(xiàn)場發(fā)酵的應(yīng)用包括以下步驟:一、將上述所制 備的地衣芽孢桿菌制劑與水的比例按1:10至1:30的比例攪拌均勻，調(diào)PH至8-8.2，前12小時 每分鐘通氣量液氣比為1:0.5，12小時后通氣量為1:0.8，培養(yǎng)24小時后即為現(xiàn)場發(fā)酵的地 衣芽孢桿菌的發(fā)酵液； 二，用于養(yǎng)殖池塘調(diào)水，將步驟一所制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵酵液以1:50至1:100的比 例稀釋全池潑灑，其發(fā)酵液的用量為1-2L/畝； 三，用于調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水產(chǎn)動物腸道，將步驟一制備的地衣芽孢桿菌發(fā)酵液以飼料的1%-2% 的量與飼料拌勻飼喂。
[0009] 其中，步驟一所述的水是井水，干凈河水，放置一天以后的自來水等的一種。
[0010] 其中，步驟一所述的空氣是未經(jīng)過濾或滅菌的。
[0011] 其中，該地衣芽孢桿菌制劑中含有納他霉素，納他霉素是26種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗 真菌抗生素的一種，主要由3種鏈霉菌產(chǎn)生，分別是恰努加鏈霉菌（St re ptomyces chattanovgensis)、納塔爾鏈霉菌 Streptomyxes natalensis)和褐黃抱鏈霉菌 (Streptomyxes gilvosporeus)，經(jīng)發(fā)酵、提取、精制獲得的具有廣譜、雙效的生物防腐劑。 它既可以抑制各種霉菌、酵母的生長引起的食品腐敗，又能抑制真菌毒素的產(chǎn)生，防止造成 毒素型食物中毒。1996年，我國批準(zhǔn)納他霉素用于干酪、肉制品、月餅、糕點(diǎn)、果汁原漿以及 易發(fā)霉的食品加工器皿的表面防腐。納他霉素也被批準(zhǔn)直接添加到發(fā)酵酒、酸奶和色拉醬 中，限量為l〇mg/kg。納他霉素對人體無毒，而且無致突變、致癌、致畸和致敏作用，并且很難 被哺乳動物消化道吸收。給動物飼喂高劑量的納他霉素，90%以上以原型及其分解產(chǎn)物隨糞 便排出。研究表明，自然條件下，微生物很難產(chǎn)生對納他霉素的抗性。納他霉素的臨床醫(yī)學(xué) 應(yīng)用范圍也很廣泛，可以用于抗皮膚、粘膜、陰道和肺部的真菌感染。納他霉素是國際上唯 一獲得批準(zhǔn)的抗真菌生物防腐劑，是一種高效、安全的新型生物防腐劑。納他霉素是一種多 烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，多烯是一平面大環(huán)內(nèi)酯環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞上留醇化合物相互作 用具有高度親和性，由此引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變而破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏，使細(xì)胞死 亡。但有些微生物如細(xì)菌的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)膜不存在這些留醇化合物，所以納他霉素對細(xì) 菌沒有作用。
[0012]本發(fā)明中地衣芽孢桿菌制劑中含有硫酸粘桿菌素，粘桿菌素(Colistin)又名抗敵 素、多粘菌素 E<a950年，由日本小山康夫等從福島縣土壤中分離到一株多粘芽胞桿菌抗敵 素變株(Bacillus polymyxa var colistin)培養(yǎng)液中產(chǎn)生的一種鎖環(huán)狀多肽抗生素。它與 敏感菌胞漿膜中脂蛋白的游離磷酸鹽相結(jié)合，使胞漿膜表面張力降低，通透性增加，導(dǎo)致胞 漿膜失去屏障作用而使細(xì)胞內(nèi)嘌嶺、嘧啶、核苷酸等外漏而死亡，屬殺菌類抗生素。粘桿菌 素對大部分革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，如大腸桿菌、沙門氏菌、假單胞菌等，但對革 蘭氏陽性菌及真菌幾乎無效。
[0013]本發(fā)明的地衣芽孢桿菌菌劑制劑以1:10-1:30的比例溶于水后，調(diào)PH至8-8.2，較 高的PH下，在擴(kuò)繁發(fā)酵前期能較好的抑制乳酸菌的生長，一旦芽孢菌快速萌發(fā)繁殖后，就能 產(chǎn)生細(xì)菌素之類的抑制住乳酸菌的生長。
[0014] 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌制劑中含有肌苷，絲氨酸，果糖等芽孢萌發(fā)劑，自然界中芽 孢萌發(fā)受外源營養(yǎng)物質(zhì)的影響，這類營養(yǎng)物質(zhì)被稱之為"萌發(fā)劑"，通常情況下，芽孢和促進(jìn) 萌發(fā)的芽孢萌發(fā)劑混合后數(shù)秒鐘之內(nèi)，萌發(fā)劑快速跨過芽孢衣和皮層到達(dá)芽孢內(nèi)膜的表 面，與位于芽孢內(nèi)膜上的受體蛋白相互作用，激發(fā)芽孢進(jìn)入萌發(fā)狀態(tài)，接著啟動一連串萌發(fā) 事件，之后的萌發(fā)過程不會因移走萌發(fā)劑而停止。本發(fā)明中的肌苷與絲氨酸是本發(fā)明人通 過一系列的單因素試驗(yàn)從20種萌發(fā)劑中篩選得到的對地衣芽孢有明顯的提高其芽孢萌發(fā) 作用的萌發(fā)劑，兩種萌發(fā)劑復(fù)配后能有效提高其芽孢萌發(fā)速度。
[0015] 本發(fā)明中含有大量的玉米粉，玉米漿，紅糖，都是適合促進(jìn)芽孢桿菌發(fā)酵繁殖的營 養(yǎng)劑，一旦芽孢萌發(fā)則會快速促進(jìn)芽孢桿菌的繁殖與倍增。
[0016] 本發(fā)明采用上述方案的有益效果:地衣芽孢桿菌制劑與水按1:10-1:30的比例混 合