一株地衣芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境工程、生物領域，涉及一株具有好氧反硝化性能的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B2菌株及其在高溫環(huán)境下脫除廢水中脫除水中的硝酸根與亞硝酸根的應用。
【背景技術】
[0002]農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式發(fā)生了重大改變，農(nóng)藥、化肥大量使用且與日倶增。農(nóng)藥化肥施于農(nóng)作物上，其中1 %?20 %附著在植物體上，其余80 %?90 %散落在土壤、水體、大氣中。農(nóng)藥化肥通過地表徑流或降水帶入等方式進入地表水體，造成富營養(yǎng)化，甚至污染地下水。印染和紡織廢水、煉油廢水、肉類加工和飼料生產(chǎn)廢水等都含有高濃度的氨氮和硝酸鹽。另外，由于能源需求日益強勁，礦物燃料的燃燒、汽車尾氣的排放量不斷增加，大氣中活性氮化合物含量近年來迅速增長。氮污染不僅破壞生態(tài)系統(tǒng)，也嚴重危害到人體健康。
[0003]在眾多處理硝酸氮廢水的研究中生物脫除法具有對環(huán)境影響程度輕、工藝簡單等優(yōu)點，作為一種綠色高效的處理技術而越來越被重視。而在廢氣脫氮治理方法中，生物過濾法作為一種低成本、高效率、無二次污染的方法，已成為大氣污染控制領域熱點之一。
[0004]最早提出好氧反硝化(aerobicdenitrificat1n)的是Robertson和KuenenJtMH在實驗室中觀察到在氧氣存在的條件下發(fā)生了反硝化現(xiàn)象。國內(nèi)外學者在好氧反硝化領域進行了廣泛深入的研究，證明好氧反硝化較之傳統(tǒng)反硝化技術存在明顯優(yōu)勢。近年來，不斷有好氧反硝化菌被分離出來，存在于副球菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿菌屬、芽孢桿菌屬等50多個屬。然而這些報道的好氧反硝化菌大多生長于常溫環(huán)境下(25?35°C)，關于高溫條件下(40°C以上)的好氧反硝化菌報道較少，由于目前很多工業(yè)廢水都超過40°C，高溫菌可直接處理高溫廢水，節(jié)省成本。另外，在30?50°C均能保持高效反硝化效能的菌種更鮮有報道。生物法的其中一個缺點是容易受溫度波動的影響，因此，篩選分離在較廣溫度范圍下(包括尚溫)具有尚效性能的好氧反硝化細菌的研究具有實際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明之目的是提供一種在較廣溫度范圍下(包括高溫)具有高效好氧反硝化性能的菌株及其用途。
[0006]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0007]本發(fā)明較廣溫度范圍下具有高效好氧反硝化性能的菌株是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B2，該菌株具有以下特征:
[0008](I)菌落特征:菌落表面不光滑不透明，邊緣不整齊;桿菌，菌體單個，成對或鏈狀排列;革蘭氏染色陽性;芽孢橢圓形，中生；
[0009](2)糖、醇類發(fā)酵試驗顯示為發(fā)酵型，接觸酶、厭氧生長、V-P測定、硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、酪素水解等實驗均為陽性，氧化酶、卵磷脂酶、吲哚、酪氨酸、苯丙氨酸脫氨酶等實驗均為陰性，可進行反硝化作用，能利用硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮生長；
[0010](3)該菌株的16S rDNA基因序列特征:其16S rDNA具有序列表所示的核苷酸序列，其16S rDNA具有序列的片段長度為1272bp，在GenBank中的登錄號為N0.KT777466，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16SrDNA進行BLAST比對，結果表明該菌株與地衣芽孢桿菌(Bacillus Iicheniformis)的同源性為99%，其中與菌株BaciIIus Iicheniformisstrain AVl2最相似，同源性達99%。
[0011 ] 應用MEGA軟件采用Neighbor-Joining法構建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其進化地位，結合其形態(tài)特征和生理生化特征，該菌株最有可能是地衣芽孢桿菌屬(Baci I IusIicheniformis)，并命名為Bacillus licheniformis B2。
[0012]所述地衣芽孢桿菌用于含氮廢水的脫氮處理，或用于含NOx煙氣脫硝處理。地衣芽孢桿菌B2對溫度耐受程度強，在30?50°C條件下生長且具有高效的好氧反硝化能力，硝酸鹽去除率均^ 99%，并且沒有亞硝酸鹽積累。此外，地衣芽孢桿菌B2對氧氣的耐受性強，在
11.2mg/L溶解氧濃度下，硝酸鹽去除率仍達98.7%,且沒有亞硝酸鹽積累。以上特性表明該菌株能應用于溫度波動大、氧氣含量高的實際高溫廢水或煙氣中，將含氮污染物還原為氮氣，達到脫氮的目的。
[0013]優(yōu)選地，所述地衣芽孢桿菌B2用于30?50°C含氮廢水的高效好氧反硝化脫氮處理。
[0014]優(yōu)選地，所述地衣芽孢桿菌B2用于30?50°C煙氣波動情況下的高效好氧反硝化脫硝處理。
[0015]所述地衣芽孢桿菌B2脫氮、脫硝處理的條件為:利用葡萄糖、蔗糖或丁二酸鈉為碳源，控制C/N為6?15，pH為7?9，振蕩轉速為120?200rpm。
[0016]優(yōu)選地，所述C/N為9，pH為8，振蕩轉速為160rpm。
[0017]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0018](I)本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌生長溫度范圍廣，且具有高效好氧反硝化能力，能應用于處理硝酸鹽廢水或含NOx的煙氣。
[0019](2)該菌株可在30?50°C下在24小時內(nèi)對初始濃度為140mg/L硝酸鹽氮去除率達99%以上，并且沒有亞硝酸鹽積累。
[0020](3)該菌株的發(fā)現(xiàn)可解決溫度波動對生物脫氮脫硝影響大的難題。
[0021 ] 本發(fā)明所述地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)B2，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(簡稱CCTCC)，其保藏編號是CCTCC Ν0:Μ 2015590，保藏日期為2015年10月8日，保藏地址為中國武漢大學。
【附圖說明】
[0022]圖1為Bacilluslicheniformis B2的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
[0023]圖2不同碳源下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比較圖。
[0024]圖3不同C/N下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比較圖。
[0025]圖4不同轉速下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比較圖。
[0026]圖5不同pH下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比較圖。
[0027]圖6不同溫度下菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能比較圖。
[0028]圖7為煙氣脫硝生物過濾裝置示意圖，進氣口1、霧化器增濕器2、溫度控制器3，生物滴濾塔4、恒溫水浴鍋5、質量流量計6、出氣口 7。
[0029]圖8為在真實煙氣環(huán)境下培養(yǎng)菌Bacillus licheniformis B2的反硝化性能圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術進行。
[0031]實施例1:菌種的分離、純化及鑒定
[0032]本研究向玉米葉水解液中接入不含碳源的反硝化培養(yǎng)基，初始溫度為40°C，160rpm的振蕩培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后，以體積比為10%的接種量接入90mL無菌的含反硝化培養(yǎng)基的玉米葉水解液中。重復上述步驟3天后發(fā)現(xiàn)菌液生長良好，并且脫氮率達到了85%以上。經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液通過倍比稀釋法后涂布平板以分離出單菌落。將菌液取ImL至裝有9mL無菌水的試管中，充分混合后得到10—1梯度的菌懸液，以此類推制備10—2?10—8不同梯度的菌懸液，為了獲得可以清晰觀察的菌落形態(tài)，選取I O—4、I O—5、10—6三個梯度的菌懸液，各取0.1mL涂布至已制備好的帶有溴百里酚藍(BTB)顯色的反硝化固體培養(yǎng)基上，倒置放入40°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)2天后，可見平板中長有單菌落，由于BTB指示劑的作用，發(fā)生反硝化作用的菌落周圍產(chǎn)生藍色暈圈。從平板中挑取形態(tài)不同且周圍有藍色暈圈的單菌落，在無菌的反硝化固體培養(yǎng)基中劃線后放置在40°C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如此重復三次得到純菌落。
[0033]在復篩階段將上述分離得到后的不同形態(tài)的單菌落分別接種于裝有90ml的無菌反硝化培養(yǎng)基中，在40°C，160rpm條件下振蕩培養(yǎng)24小時，取培養(yǎng)后的菌液測量0D6QQ值以及培養(yǎng)液中的硝態(tài)氮濃度包括硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，考察菌株在24h內(nèi)的生長狀況和硝態(tài)氮去除效果，最后篩選出一株優(yōu)勢菌株編號為B2，其24h內(nèi)脫氮率大于95%。
[0034]將上述分離純化得到的菌株進行生理生化鑒定及16SrDNA測序。PCR引物為通用引物ieSFA' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-37 (上游引物)和 16SR: 5' -GGTACCTTGTTACGAC TT-37(下游引物)ICR擴增反應條件為:94°C預變性Imin，經(jīng)過30個循環(huán)，56°C退火Imin，72°C擴增2min，最后72°C延伸7min。得到的產(chǎn)物進行16S rDNA測序(上海英俊生物技術有限公司)，片段長度為1272bp。將測序結果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST，結果得出B2與Baci I Iuslicheniformis同源性達99%，命名為Bacillus licheniformis B2(GenBank登錄號為KT777466)。利用MEGA軟件進行多序列比，運用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，詳見圖1。為了進一步確定鑒定結果的可靠性，請廣東省微生物分析測試中心對該菌進行生理生化鑒定，最終確定該菌為地衣芽孢桿菌BaciIIus licheniformis。
[0035]實施例2:地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis)B2反硝化性能測定
[0036]1、不同碳源下Bacillus licheniformis B2的反硝化性能
[0037]考察菌株B2對不同碳源的利用情況，包括葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉這5種碳源。具體操作步驟如下: