合肝細(xì) 胞作為內(nèi)胚層細(xì)胞的空間分布規(guī)律。擬胚體是包含三個(gè)胚層細(xì)胞的胚胎結(jié)構(gòu)，其中內(nèi)胚層 細(xì)胞在胚胎發(fā)育早期首先分布于胚體外緣。當(dāng)擬胚體貼壁按二維空間生長后，大部分內(nèi)胚 層細(xì)胞就處于細(xì)胞分化群落的外周。同時(shí)，擬胚體中心的細(xì)胞仍然處于各級干細(xì)胞水平，可 以不斷分化出包括內(nèi)胚層的三胚層細(xì)胞，加上擬胚體貼壁時(shí)與培養(yǎng)瓶接觸點(diǎn)的外緣部分的 內(nèi)胚層細(xì)胞，使得內(nèi)胚層細(xì)胞在細(xì)胞分化群落的外緣及中心部位存在。
[0052] 實(shí)施例2
[0053] (1)BALB/c系小鼠胚胎干細(xì)胞(購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)在5% C02培養(yǎng)箱中37 °c條件下在擬胚體液體培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)開始分化，約10h后即可見胚胎干細(xì) 胞形成圓球狀擬胚體并懸浮在培養(yǎng)液中，擬胚體在6d的培養(yǎng)時(shí)間里不斷增大;培養(yǎng)6天后， 得到擬胚體；
[0054] (2)第7天，將步驟（1)得到的擬胚體移至24孔板中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每個(gè)擬胚體以貼 壁點(diǎn)為中心向四周輻射分化生長形成細(xì)胞分化群落;胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)，用細(xì)胞鏟 整塊刮取位于細(xì)胞分化群落區(qū)域1和/或細(xì)胞分化群落區(qū)域2(區(qū)域1位于細(xì)胞分化群落中心 區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至 中心距離)的1/5;區(qū)域2為細(xì)胞分化群落區(qū)域3之外的區(qū)域;區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心 區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心 距離）的4/5)的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其再次貼壁培養(yǎng)，得到胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞;其 中：
[0055]貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成；所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng) 基;所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為20%的胎牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙 醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和終濃度為100yg/mL的鏈霉素；
[0056] 貼壁培養(yǎng)過程中，肝性生長因子的加入時(shí)間和用量為：
[0057] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~19天，加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的 TGF；
[0058] 胚胎干細(xì)胞分化第7天~10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF;
[0059] 胚胎干細(xì)胞分化第11~19天，終濃度為40ng/mL的HGF;
[0060] 胚胎干細(xì)胞分化第15~19天，加入終濃度為10ng/mL的0SM、終濃度為10-7Μ的地塞 米松、終濃度為5yg/mL胰島素和終濃度為5yg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白；
[0061] (3)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中的鑒定
[0062]①加入HGF等肝性生長因子后細(xì)胞分化群落外周形成比較均一的細(xì)胞群，說明生 長因子的定向誘導(dǎo)作用使擬胚體向單一類型細(xì)胞分化（圖1A~圖1C)，從圖1C中可看出，每 個(gè)細(xì)胞分化群落即是由圖1B中的單個(gè)擬胚體貼壁生長后分化而成，每個(gè)細(xì)胞分化群落包含 多量細(xì)胞。
[0063]②本實(shí)施例在胚胎干細(xì)胞分化第15d，用細(xì)胞鏟整塊刮取擬胚體細(xì)胞分化群落的 區(qū)域1和區(qū)域2的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)貼壁培養(yǎng);經(jīng)鑒定，分選并重 新培養(yǎng)的細(xì)胞中，肝細(xì)胞比率或純度明顯上升，可由31.2%上升至80.1%，細(xì)胞生長狀態(tài)良 好，細(xì)胞活力不受影響：其中，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)4d后，采用RT-PCR(引物序列為^??4 :5'_ TCGTATTCCAACAGGATA-3,;AFP-R:5,-AGGCTTTTGCTTCACCAG-3 ,;ALB-F:5,-GCTAGGCACACAGTGCTTG-3，；ALB-R:5，-CAGGATTGCAGACAGATAGTC-3， ；TAT-F:5，-ACCTTCAATCCCATCCGA-3'；TAT-R：5'-TCCCGACTGGATAGGTAG-3'；G6P-F:5^ CAGGACTGGTTCATCCTT-3 ' ； G6P-R: 5 ' -GTTGCTGTAGTAGTCGGT-3 '）免疫細(xì)胞化學(xué)（抗體及試劑 盒同步驟①)和RIA方法(放射免疫法(RIA)試劑盒(北京中國原子能研究院））檢測細(xì)胞表達(dá) ALB和尿素等肝細(xì)胞標(biāo)記物情況，其中，對照組為胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)不進(jìn)行特定區(qū) 域(細(xì)胞分化群落的區(qū)域1和區(qū)域2)細(xì)胞分選，直接繼續(xù)貼壁培養(yǎng)4d，整個(gè)培養(yǎng)階段的其他 操作同步驟(1)、（2);
[0064]經(jīng)檢測，經(jīng)過特定區(qū)域分選后繼續(xù)貼壁培養(yǎng)4d后，得到的的肝細(xì)胞的肝性標(biāo)記物 ALB、TAT、G6P等表達(dá)水平較對照組明顯提高，培養(yǎng)上清液中ALB濃度較分選前由4.25 ± 0.50 yg/mL明顯上升為11.32 ± 1.12yg/mL，尿素濃度較分選前由61.33 ± 0.97yg/mL明顯上升為 148.31 ±23.36yg/mL，這表明分選后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可滿足肝細(xì)胞移植的細(xì)胞純度 和細(xì)胞功能要求。
[0065] ③圖3是細(xì)胞分選前后，顯微鏡下細(xì)胞分化群落或肝細(xì)胞形態(tài)圖；其中，圖3A為細(xì) 胞分選前細(xì)胞分化群落形態(tài)，從圖中可以看出，擬胚體細(xì)胞分化群落為圓形分布，其中包含 多種類型分化細(xì)胞，肝細(xì)胞僅占其中一小部分；圖3B為細(xì)胞分選后培養(yǎng)得到的肝細(xì)胞形態(tài)， 從圖中可以看出，免疫組化染色ALB陽性的分化肝細(xì)胞數(shù)量和純度明顯提高，細(xì)胞貼壁均勻 生長。
[0066] 實(shí)施例3
[0067] (1)同實(shí)施例2;
[0068] (2)胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)，用細(xì)胞鏟整塊刮取位于細(xì)胞分化群落區(qū)域1和/或 細(xì)胞分化群落區(qū)域2(區(qū)域1位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距 離不超過細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離)的1/4;區(qū)域2為細(xì)胞分化群落 區(qū)域3之外的區(qū)域;區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距 離為細(xì)胞分化群落半徑(細(xì)胞分化群落邊緣至中心距離）的3/4)的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其 再次貼壁培養(yǎng)，得到胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞;其他操作同實(shí)施例2;
[0069] 經(jīng)鑒定，分選并重新培養(yǎng)的細(xì)胞中，肝細(xì)胞比率或純度明顯上升，可由31.0%上升 至 75.8%。
[0070]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于包含如下步驟： (1) 胚胎干細(xì)胞在擬胚體液體培養(yǎng)基中搖動培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)開始分化，得到擬胚體； (2) 將步驟(1)得到的擬胚體進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每個(gè)擬胚體以貼壁點(diǎn)為中心向四周輻射分 化生長形成細(xì)胞分化群落;胚胎干細(xì)胞分化至第15d時(shí)，刮取位于細(xì)胞分化群落區(qū)域1和/或 細(xì)胞分化群落區(qū)域2的正常生長狀態(tài)細(xì)胞，將其再次貼壁培養(yǎng)，得到胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì) 胞； 步驟(2)中所述的區(qū)域1為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心 的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑的1/4; 步驟(2)中所述的區(qū)域2為細(xì)胞分化群落區(qū)域3之外的區(qū)域； 所述的區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì) 胞分化群落半徑的3/4。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟(2)中所述的貼壁培養(yǎng)過程中添加肝性生長因子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 所述的肝性生長因子為EGF、TGF、HGF、OSM、地塞米松、胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白中的至少一 種。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 所述的肝性生長因子加入時(shí)間和用量為： 胚胎干細(xì)胞分化第7天~19天，加入終濃度為30ng/mL的EGF和終濃度為30ng/mL的TGF; 胚胎干細(xì)胞分化第7天~10天，加入終濃度為20ng/mL的HGF; 胚胎干細(xì)胞分化第11~19天，終濃度為40ng/mL的HGF; 胚胎干細(xì)胞分化第15~19天，加入終濃度為10ng/mL的OSM、終濃度為1(Γ7Μ的地塞米松、 終濃度為5yg/mL的胰島素和終濃度為5yg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的胚胎干細(xì)胞為BALB/c系小鼠胚胎干細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟(2)中所述的區(qū)域1為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心 的距離不超過細(xì)胞分化群落半徑的1/5; 所述的區(qū)域3為位于細(xì)胞分化群落中心區(qū)域且其邊緣至細(xì)胞分化群落中心的距離為細(xì) 胞分化群落半徑的4/5。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟(1)中所述的擬胚體液體培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成； 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基；所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為20 %的胎 牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和 終濃度為100yg/mL的鏈霉素。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟(1)中所述的搖動培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的時(shí)間為培養(yǎng)6天。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法，其特征在于： 步驟(2)中所述的貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成； 所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基；所述的添加物包含如下組分:體積分?jǐn)?shù)為20 %的胎 牛血清、終濃度為0.1M的2-巰基乙醇、終濃度為25mM的HEPES、終濃度為100U/mL的青霉素和 終濃度為100yg/mL的鏈霉素。10.權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述的胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞的分選方法。本發(fā)明將胚胎干細(xì)胞搖動培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)為擬胚體，然后將擬胚體貼壁培養(yǎng)，逐漸生長分化為圓形的分化細(xì)胞群落，根據(jù)分化肝細(xì)胞在圓形細(xì)胞群落中的空間分布規(guī)律，在特定時(shí)期選擇特定區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行分選并重新貼壁培養(yǎng)。在上述貼壁培養(yǎng)過程中，根據(jù)細(xì)胞分化情況，選擇EGF、TGF、HGF、OSM等作為擬胚體向肝細(xì)胞分化過程中的肝性生長因子，以促進(jìn)肝細(xì)胞分化，整個(gè)分選過程操作簡單、成本低、可明顯減輕細(xì)胞損傷、干細(xì)胞分化率相較于現(xiàn)有技術(shù)得到大幅度提高，分選后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可滿足肝細(xì)胞移植的細(xì)胞純度和細(xì)胞功能要求。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105441382
【申請?zhí)枴緾N201610013182
【發(fā)明人】胡安斌
【申請人】中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2016年1月6日