Nk細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells,NK細(xì)胞），作為與T細(xì)胞、B細(xì)胞并列的一大 類(lèi)淋巴細(xì)胞群體，是天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細(xì)胞除了參與先天性免疫應(yīng)答之外，還在 適應(yīng)性免疫的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的調(diào)控作用。NK細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞(包 括部分細(xì)胞系）、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞(如血細(xì)胞）、寄生蟲(chóng)等，因此，NK細(xì)胞是 機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Π 型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)。綜上， NK細(xì)胞的離體擴(kuò)增和激活時(shí)促進(jìn)臨床頻繁應(yīng)用的關(guān)鍵，而目前NK細(xì)胞的擴(kuò)增方法主要包括 在二維培養(yǎng)前分離NK前體或CD56以及使用飼養(yǎng)細(xì)胞等步驟，不僅需要飼養(yǎng)細(xì)胞、操作較繁 瑣，而且NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果不明顯，且所獲得的NK細(xì)胞殺傷活性較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)于二維環(huán)境中擴(kuò)增NK細(xì)胞存在NK細(xì) 胞擴(kuò)增率低且殺傷活性差等缺陷，提供一種能夠提高NK細(xì)胞擴(kuò)增率及殺傷活性的NK細(xì)胞的 體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:提供一種NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培 養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：
[0005] 獲取NK細(xì)胞；
[0006] 將所述NK細(xì)胞接種于三維培養(yǎng)支架中進(jìn)行體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)；其中，三維培養(yǎng)支 架為殼聚糖-海藻酸鈉支架。
[0007] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述殼聚糖-海藻酸鈉支架 的制備過(guò)程，包括以下步驟：
[0008] 取海藻酸鈉溶于蒸餾水中，殼聚糖溶于醋酸溶液中，加熱溶脹；用冰醋酸分別調(diào)節(jié) 殼聚糖和海藻酸鈉溶液的pH至3.0~5.0后，混合均勻，真空脫泡后于-5°C-198°C下冷凍并 凍干。
[0009] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述殼聚糖-海藻酸鈉支架 的制備過(guò)程，還包括在殼聚糖和海藻酸鈉溶液混合后，添加除鎂離子以外的二價(jià)金屬離子 鹽溶液的步驟。
[0010] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，獲取NK細(xì)胞的過(guò)程，包括以 下步驟：
[0011] 獲?、?4+造血干細(xì)胞于含有造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行刺激分 化成NK細(xì)胞。
[0012] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子包 括白介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18。
[0013]在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中，白介 素2的濃度為100_300U/ml、IL-12的濃度為0.5-4.5ng/ml、白介素-15的濃度為2-8ng/ml以 及白介素-18的濃度為5-15ng/ml。
[0014]在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子包 括白介素-2,且所述造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子中還添加有抗⑶3單克隆抗體。
[0015] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基中，白介 素-2的濃度為5-15ng/ml、抗CD3單克隆抗體的濃度為5-15ng/ml。
[0016] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，對(duì)所述NK細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增 培養(yǎng)的步驟為:將所述殼聚糖-海藻酸鈉研碎加入乙酸中復(fù)溶，并添加所述含有造血干細(xì)胞 生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基，接種所述NK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)20-50天。
[0017] 在本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法中，所述⑶34+造血干細(xì)胞的獲 取過(guò)程，包括以下步驟：
[0018] 從血細(xì)胞中分離出單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)磁珠分選出⑶34+造血干細(xì)胞。
[0019]實(shí)施本發(fā)明提供的NK細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效果:本發(fā)明通 過(guò)采用殼聚糖-海藻酸鈉支架對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，利用殼聚糖-海藻酸鈉支架的多孔隙 結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能和生物相容性，擴(kuò)大了NK細(xì)胞的生長(zhǎng)空間及與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，也 可使得NK細(xì)胞能夠均勻分布在殼聚糖-海藻酸鈉支架中，避免細(xì)胞聚集成團(tuán)，促進(jìn)NK細(xì)胞與 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸，從而能夠提高NK細(xì)胞的細(xì)胞活性，有利于提高NK細(xì)胞的擴(kuò)增率及其殺傷 活性;從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中采用飼養(yǎng)細(xì)胞于二維環(huán)境中培養(yǎng)NK細(xì)胞存在的NK細(xì)胞活性 差、擴(kuò)增率低等缺陷模擬NK細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中NK細(xì)胞于二維環(huán)境中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)的方式存在擴(kuò)增率低、NK細(xì) 胞殺傷活性差等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種NK細(xì)胞的三維擴(kuò)增培養(yǎng)方式，通過(guò)利 用殼聚糖-海藻酸鈉支架的多孔隙結(jié)構(gòu)及其機(jī)械性能和生物相容性，擴(kuò)大了 NK細(xì)胞的生長(zhǎng) 空間及與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，也可使得NK細(xì)胞能夠均勻分布在殼聚糖-海藻酸鈉支架中， 從而能夠提高NK細(xì)胞的細(xì)胞活性，有利于提高NK細(xì)胞的擴(kuò)增率及其殺傷活性;從而解決了 現(xiàn)有技術(shù)中采用飼養(yǎng)細(xì)胞于二維環(huán)境中培養(yǎng)NK細(xì)胞存在的NK細(xì)胞活性差、擴(kuò)增率低等缺 陷。
[0021] 具體地，本發(fā)明提供的NK細(xì)胞的體外三維擴(kuò)增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0022] S1、獲取NK細(xì)胞；
[0023] S2、將NK細(xì)胞接種于三維培養(yǎng)支架中進(jìn)行體外三維擴(kuò)增培養(yǎng);其中，三維培養(yǎng)支架 為殼聚糖-海藻酸鈉支架。
[0024]進(jìn)一步地，在步驟S1中，NK細(xì)胞可來(lái)自于外周血、臍帶血、蛻膜組織和/或淋巴結(jié)。 NK細(xì)胞表面表達(dá)CD56抗原，不表達(dá)CD3抗原，根據(jù)CD56抗原的不同表達(dá)，NK細(xì)胞可分為 CD56dimCD16brighmCD56bl:ightCD16 dim/neg兩大亞群；CD56brightCD16dim/neg NK細(xì)胞則主要存在于 淋巴結(jié)以及蛻膜組織中，以分泌細(xì)胞因子如干擾素-γ為主要功能，殺傷功能較弱；而 CD56dimCD16bnghtNK細(xì)胞則主要存在于外周血中，有豐富的胞內(nèi)穿孔素，殺傷功能較強(qiáng)，因 此，在本發(fā)明中，優(yōu)先采用從外周血中獲取NK細(xì)胞。
[0025] NK細(xì)胞主要是由⑶34+造血干細(xì)胞在造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激下分化發(fā)育為成 熟的NK細(xì)胞，NK細(xì)胞的發(fā)育階段為:從CD34+造血干細(xì)胞先分化為共同淋巴樣前提細(xì)胞，共 同淋巴樣前提細(xì)胞再生成NK前體細(xì)胞，NK前體細(xì)胞發(fā)育為不成熟NK細(xì)胞，最后，不成熟NK細(xì) 胞獲得活化性和抑制性受體，并獲得功能發(fā)育為成熟的NK細(xì)胞。
[0026] 進(jìn)一步地，獲取NK細(xì)胞的過(guò)程，包括以下步驟:獲?、?4+造血干細(xì)胞于含有造血 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0027]其中，用于將⑶34+造血干細(xì)胞分化發(fā)育成NK細(xì)胞的造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括白 介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18;且優(yōu)選地，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中，白介素-2的 濃度為100_300U/ml、IL-12的濃度為0.5-4.5ng/ml、白介素-15的濃度為2-8ng/ml以及白介 素-18的濃度為5-15ng/ml。
[0028]白介素-2能夠誘導(dǎo)⑶34+造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成NK細(xì)胞，且經(jīng)白介素-2誘導(dǎo)⑶34+造血 干細(xì)胞所獲得NK細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用，增強(qiáng)了NK細(xì)胞的殺傷活性；同時(shí)，白介素-2還 能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，維持NK細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng);且能夠在短時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性；IL-2 還能促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN- γ，增加其表達(dá)IL-2R+亞基等。
[0029]白介素-12能夠誘導(dǎo)ΝΚ細(xì)胞產(chǎn)生IFN_y等細(xì)胞因子，有利于促進(jìn)ΝΚ細(xì)胞的生長(zhǎng)增 殖及活性提尚。
[0030] 白介素18能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的溶解活性，激活NK細(xì)胞的活性，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒 作用，又可促進(jìn)穿孔素介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞傳統(tǒng)的殺傷活性。
[0031] 白介素-15不僅能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖與分化，而且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞NKG2D這 一活化性受體的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷相關(guān)性基因如穿孔素的表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺 傷功能。
[0032] 在這些生長(zhǎng)因子的刺激下，造血干細(xì)胞數(shù)量增加，并且造血干細(xì)胞隨著分化其表 型也發(fā)生變化，發(fā)育早期階段，干細(xì)胞上的IL-2/IL-15R-i3細(xì)胞因子受體，即⑶122的表達(dá)出 現(xiàn)上調(diào)，干細(xì)胞隨之分化為NK前體細(xì)胞，NK前體細(xì)胞具有定向發(fā)育為成熟NK