一種單胺氧化酶及其在合成手性氮雜雙環(huán)化合物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種單胺氧化酶，含有該酶編碼基因的重組 表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，表達(dá)的重組酶和該重組酶的制備方法，以及該單胺氧化酶作 為催化劑在合成博西普韋中間體中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 博昔普韋（boceprevir)及特拉匹韋（telaprevir)是丙型肝炎病毒（HCV)蛋白酶 抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0003]
[0004] III期SPRINT-2研究顯示，與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，24周的博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療可提高HCV 基因1型初治患者的SVR率。博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療24周與博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療44周的抗病毒 療效相似。
[0005] 片段A是合成博昔普韋的關(guān)鍵中間體之一，片段A的結(jié)構(gòu)如下：
[0006]
[0007] 目前關(guān)于片段A主要有如下合成路線：
[0008] 路線1 :TO2007075790公開了利用6, 6-二甲基-3-氧雜雙環(huán)[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮將內(nèi)酯內(nèi)酰胺化、羰基還原、還原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的鹽，具 體反應(yīng)路線如下所示：
[0009] 123456 由于此路線中的氰基加成利用了硝酸銀、氰化鉀和鹽酸，成本較高，對(duì)于后處理和 三廢處理也帶來了很大困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。 2 路線 2 :文獻(xiàn)（Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49, No. 20, 6074-6086 )中公開了一種以3-苯基四氫吡咯[l，2-c]惡唑-5(1H)_酮為原料，經(jīng)過去氫、環(huán)丙烷化、 開環(huán)、還原、氧化等一系列反應(yīng)得到關(guān)鍵片段A，具體反應(yīng)路線如下所示： 3 4 由于此路線中的還原反應(yīng)采用了氫化鋰鋁和鈀碳，反應(yīng)條件苛刻，后處理較為繁 瑣，也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。 5 路線3 :TO2004113295公開了使用6, 6-二甲基-3-氧雜雙環(huán)[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮為原料，經(jīng)過醇解、酰胺化、還原酰胺基和酯基、將氨基保護(hù)后氧化醇成醛、成 環(huán)、氰基化、水解、去保護(hù)得到片段A的鹽酸鹽，具體反應(yīng)路線如下： 6
[0016] 雖然此路線具有起始原料價(jià)廉易得優(yōu)點(diǎn)，但該路線在制備（lR，3S)-3-氨甲 基-2, 2-二甲基環(huán)丙烷基甲醇時(shí)需采取二級(jí)還原反應(yīng)，即，首先利用選自鋁烷、在三甲基硅 烷基氯存在下的硼氫化鋰或硼氫化鈉還原酯基，再使用氫化鋁鋰或三乙酰氧基硼氫化鈉還 原酰胺基，上述還原反應(yīng)條件劇烈，溫度要求苛刻，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，后處理繁瑣，安全性低， 以致影響了該路線的工業(yè)化應(yīng)用。
[0017] 路線 4 :文獻(xiàn)（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6467-6472)公開了 利用來自黑曲 霉（Aspergillus niger)的單胺氧化酶的消除-加成反應(yīng)制備（1S，2S, 5R)-6, 6-二甲 基-3-氮雜-雙環(huán)[3. 1. 0]己烷-2-腈的方法，如下所示：
[0018]
[0019] 該方法通過單胺氧化酶將前手性的胺氧化為手性亞胺，在NaHS03存在的條件下生 成加成產(chǎn)物；后者與NaCN反應(yīng)得到手性的亞胺加成產(chǎn)物（如上圖），后者甲醇解得到氨基 酸甲酯鹽酸鹽。該法立體選擇性地構(gòu)建了 3個(gè)手性中心，比化學(xué)方法簡(jiǎn)便、易于操作、對(duì)環(huán) 境友好；但是亞胺產(chǎn)物易揮發(fā)且閃點(diǎn)較低，需要額外加入NaHS03，步驟較為繁瑣。
[0020] 片段B是合成特拉匹韋的關(guān)鍵中間體之一，片段B的結(jié)構(gòu)如下：
[0021] 123 目前關(guān)于片段B的合成路線主要有如下路線： 2 路線1 :EP0600741公開了如下路線： 3
[0025] 由于由該路線合成得到的目標(biāo)物存在于油狀混合物中，需經(jīng)過硅膠柱層析分離才 能得到純品，不僅后處理繁瑣，而且無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0026] 路線2 :TO0218369公開了如下路線：
[0027]
[0028] 由于該路線采用DIBAL-H還原，不僅試劑成本較高，而且制備條件苛刻（需 在-78°C下反應(yīng)），因此此路線也不適合于工業(yè)化生產(chǎn)要求。
[0029] 路線3 :CN101463001中公開了如下路線：
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[0031] 該路線使用了劇毒的羰基鈷，不僅成本太高，而且無法滿足環(huán)保要求，因此該路線 也不能滿足產(chǎn)業(yè)化要求。
[0032] 路線4 :W02008090819公開了如下路線：
[0033] 12 由于該路線的起始原料難以合成、不能批量購(gòu)得，因此也不適合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】
2 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)已報(bào)道的制備博西普韋中間體片段A和特 拉匹韋中間體片段B的反應(yīng)中收率低、原料成本昂貴、反應(yīng)不完全、對(duì)應(yīng)選擇性不高或 者對(duì)環(huán)境不友好等問題，提供了一種催化活性高、對(duì)映選擇性強(qiáng)、底物耐受性好的單胺 氧化酶進(jìn)行酶催化合成（lS，2S，5R)-6,6-二甲基-2-取代-3-氮雜雙環(huán)[3. 1.0]己烷 或（lS，3aR，6aS)-1-取代-八氫環(huán)戊[c]吡咯，進(jìn)而進(jìn)一步合成（13,23,51?)-6,6-二甲 基-3-氮雜雙環(huán)[3. 1.0]己烷-2-腈及其水解產(chǎn)物（1S，2S，5R)-6, 6-二甲基-3-氮雜雙 環(huán)[3. 1.0]己烷-2-甲酸甲酯，或進(jìn)一步合成（lS，3aR，6aS)_八氫環(huán)戊[c]吡咯-1-腈的 酶-化學(xué)合成方法。還提供了編碼該單胺氧化酶的基因，含有該基因的重組表達(dá)載體、重組 表達(dá)轉(zhuǎn)化體及其高效制備方法，以及該單胺氧化酶在催化胺氧化反應(yīng)中的用途。
[0036] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案以解決上述技術(shù)問題：
[0037] 本發(fā)明的第一方面提供了一種分離的單胺氧化酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋 白質(zhì)：
[0038] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0039] SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)由來源于環(huán)境的DNA編碼，具有單胺氧 化酶的功能，是一種新的單胺氧化酶。
[0040] (b)在（a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基衍生的 具有單胺氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
[0041] 其中，所述的"幾個(gè)"是指2個(gè)至100個(gè)，更佳地小于30個(gè)，最佳地小于10個(gè)。t匕 如添加一個(gè)外分泌信號(hào)肽的融合蛋白，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這樣的融合蛋白同樣具有單胺氧化酶 活性。也就是說，只要由（a)衍生的蛋白質(zhì)具有單胺氧化酶活性，且衍生方式如上所述，都 可以達(dá)到本發(fā)明的發(fā)明目的。根據(jù)本發(fā)明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)（a) 分子中進(jìn)行1~5個(gè)氨基酸殘基的突變，仍然保持單胺氧化酶活性。
[0042] (c)與（a)的氨基酸序列具有至少94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性且具 有單胺氧化酶活性的蛋白質(zhì)。
[0043] 發(fā)明人將SEQ ID N0:2所示的單胺氧化酶序列與其他已知單胺氧化酶進(jìn)行序列 比對(duì)，與土曲霉（Aspergillus terreus)單胺氧化酶之間的同一'丨生為93 %，與來自黑曲霉 (A. niger)的單胺氧化酶的同一性低于80%。本發(fā)明的單胺氧化酶與已知單胺氧化酶的氨 基酸序列具有顯著差異性。
[0044] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據(jù)序列的全長(zhǎng)進(jìn)行計(jì)算，優(yōu)選采用NCBI Blastp程序進(jìn)行比對(duì)，默認(rèn)參數(shù)。
[0045] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明的單胺氧化酶。優(yōu)選 地，所述核酸是由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列組成的。
[0046] SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列組成的核酸來源于環(huán)境DNA，其可以從土壤中分離 獲得，也可以從含有該核酸的重組表達(dá)載體中或重組轉(zhuǎn)化體中分離獲得，也可以全基因人 工合成獲得。
[0047] 本發(fā)明的單胺氧化酶基因命名為BYK-M0N，其編碼序列（⑶S)長(zhǎng)1479bp，起始密 碼子為ATG，終止密碼子為TAA，全長(zhǎng)編碼序列如SEQ ID NO: 1所示，其編碼的氨基酸序列如 SEQ ID N0:2 所示。
[0048] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼SEQ ID N0:2的氨基酸序列的 核苷酸序列不僅僅局限于SEQ ID N0:1。本發(fā)明的單胺氧化酶基因的核苷酸序列也可以是 編碼序列表中SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，還可以通過適 當(dāng)引入替換、缺失或插入來提供一個(gè)多聚核苷酸的同系物。本發(fā)明中多聚核苷酸的同系物 可以通過對(duì)核酸序列SEQ ID NO: 1的一個(gè)或多個(gè)堿基在保持酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失 或增加來制得。
[0049] SEQ ID NO: 1的同系物也指啟動(dòng)子變體。在所述的核酸序列之前的啟動(dòng)子或信號(hào) 序列可通過一個(gè)或多個(gè)核酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能沒有 負(fù)面影響。而且通過改變啟動(dòng)子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子完全 替換，可提商目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
[0050] SEQ ID NO: 1的同系物還指在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與SEQ ID NO: 1所示序列的多聚 核酸進(jìn)行雜交的多聚核酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行雜交可根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中描述的 方式進(jìn)行：Cold Sp