一種多酶體系的定向共固定化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多酶體系的定向共固定化方法，屬于蛋白質(zhì)固定化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞中的許多酶常常是在一個連續(xù)的反應(yīng)鏈中起作用，連續(xù)鏈反應(yīng)是指前一個酶反應(yīng)的產(chǎn)物是后一個酶反應(yīng)的底物。在完整的細(xì)胞內(nèi)的某一代謝過程中，由幾個酶形成的反應(yīng)鏈體系統(tǒng)稱多酶體系。多酶體系亦稱多酶復(fù)合體，多酶體系，多酶系統(tǒng)，多酶簇。連續(xù)反應(yīng)體系中前一反應(yīng)的產(chǎn)物為后一反應(yīng)的底物，反應(yīng)依次連接，構(gòu)成一個代謝途徑或代謝途徑的一部分。由于這一序列反應(yīng)是在一高度有序的多酶復(fù)合體內(nèi)進行，從而提高了酶的催化效率，同時利于對酶的調(diào)控。在完整細(xì)胞內(nèi)的許多多酶體系都具有自我調(diào)節(jié)能力。
[0003]將具有生物活性的黃素酶與過氧化物酶定向共固定化，可以充分利用黃素酶與過氧化物酶的協(xié)同效應(yīng)，在生物傳感器等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值。但是，傳統(tǒng)的酶固定化方法所獲得的固定化酶結(jié)構(gòu)，酶是在任意位點和載體相連接，這種方法主要不足之處在于常常導(dǎo)致固定化酶的活性出現(xiàn)大幅度下降。而黃素酶與過氧化物酶定向共固定化，是利用酶輔基與酶的親和作用，將黃素酶與過氧化物酶以有序的方向在載體特定的位點連接起來，天然構(gòu)象基本保持不變，這有助于高效實現(xiàn)這一多酶體系的生物功能，具有更重要的研究與應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的課題在于提供了一種多酶體系的定向共固定化方法，目的是克服傳統(tǒng)單酶固定化方法的種種不足，實現(xiàn)多酶體系的定向固定化的條件優(yōu)化。
[0005]為了解決上述課題，本發(fā)明采用如下技術(shù):
[0006]—種多酶體系的定向共固定化方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]步驟一，利用帶環(huán)氧鍵或羧基的載體材料上的功能基團，與3，5_二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的一個氨基進行反應(yīng)，將3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的共價鍵接到載體材料上，獲得接有3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)的載體材料，以S_( 3，5-DABA)表示;其中3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)與載體材料的質(zhì)量比為1-5:2;
[0008]步驟二，將步驟一得到的S-(3，5-DABA)與聚苯胺(PANI)反應(yīng)，反應(yīng)通過S_(3，5-DABA)上氨基苯甲酸的氨基與聚苯胺反應(yīng)，形成共價鍵，聚苯胺和S-(3，5-DABA)的質(zhì)量比為1-5:10，獲得接有聚苯胺的載體材料，以S-(3，5-DABA)-PANI表示；
[0009]步驟三，將黃素酶的輔基黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)上的氨基，與步驟二所得S-(3，5-DABA)-PANI進行反應(yīng)，通過S-(3，5-DABA)-PANI上苯甲酸的羧基與黃素腺嘌呤二核苷酸的氨基反應(yīng)，形成共價鍵，載體材料與黃素腺嘌呤二核苷酸的質(zhì)量比為1-5:2，經(jīng)酰胺鍵連接，獲得接有黃素腺嘌呤二核苷酸的載體，以S-( 3，5-DABA) -PAN1-FAD表示；
[0010]步驟四，氧化物酶的輔基(活性中心)一氯化血紅素(Hemin)上的羧基，與步驟三所得 S- (3，5-DABA) -PAN1-FAD 進行反應(yīng)，通過 S- (3，5-DABA) -PAN1-FAD 上的聚苯胺(PANI)的氨基進行反應(yīng)，形成共價鍵，所得產(chǎn)物以S-(3，5-DABA)-PAN1-FAD-Hemin表示；用還原劑對產(chǎn)物進行還原處理，還原劑與產(chǎn)物的質(zhì)量比為8000-500: 5 ;其中，氯化血紅素與S-( 3，5-DABA)-PAN1-FAD的質(zhì)量比為1:卜5。
[0011]步驟五，將脫輔基的黃素酶、脫輔基的過氧化物酶與步驟四中S-(3，5-DABA)_PAN1-FAD進行親和吸附，脫輔基的脫輔基的黃素酶、脫輔基的過氧化物酶與載體的質(zhì)量比為1: 1:1-5，獲得定向共固定化的多酶體系。在本發(fā)明中，脫輔基的黃素酶、脫輔基的過氧化物酶都可以通過正常的外購行為所得；
[0012 ]作為優(yōu)選，上述一種多酶體系的定向共固定化方法中的步驟一中所述的載體材料為氧化石墨烯、石墨烯、碳納米管、或石墨中的至少一種。
[0013]作為優(yōu)選，上述一種多酶體系的定向共固定化方法中的步驟三中所述的黃素酶為葡萄糖氧化酶(GOx)、膽固醇氧化酶、琥珀酸脫氫酶、D-氨基酸氧化酶、或脂酰CoA脫氫酶中的至少一種。
[0014]作為優(yōu)選，上述一種多酶體系的定向共固定化方法中的步驟四中所述的過氧化物酶為細(xì)胞色素、過氧化氫酶、或過氧化物酶中的至少一種。
[0015]作為優(yōu)選，上述一種多酶體系的定向共固定化方法中的步驟五中所述的還原劑為水合肼、硼氫化鈉、或檸檬酸鈉中的至少一種。。
[0016]有益效果:本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點及效果:采用將多酶體系定向共固定化，可以高效實現(xiàn)多酶體系的生物活性。
【附圖說明】
[0017]圖1共酶體系加入GOD:HRP=1:1 (lmg/ml);底物為50mM葡萄糖溶液，循環(huán)伏安法((^)檢測范圍為0?0.8￥，？六見(1):]\^ = 5400，]\111 = 4000檢測的結(jié)果
[0018]圖2共酶體系加入GOD:HRP = 1:1 (lmg/ml);底物為50mM葡萄糖溶液。循環(huán)伏安法(CV)檢測范圍為O?0.8V，PANI(氯仿):Mw = 6300，Mn = 4100檢測的結(jié)果
[0019]圖3不同enzyme固定法電化學(xué)活性對比
[0020]2R G0-3，5-PANI(2)-FAD apo-GOD+HRP GOD咬合，HRP吸附
[0021]3R G0-3，5-PANI(2)G0D+HRP雙酶吸附
[0022]4R GO-3,5-PANI(2)-FAD-Hemin apo-GOD+apo-HRP G0D、HRP均咬合
[0023]5R G0-3,5-PANI(2)-Hemin GOD+apo-HRP HRP咬合，GOD吸附
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0025]實施例1
[0026]實驗步驟:
[0027]1.氧化石墨烯(G0)_3，5-二氨基苯甲酸(3，5-DABA)
[0028]稱取氧化石墨稀1.0g，置于燒杯內(nèi)，加入200ml THF，超聲2h;再加入1.0g3，5-二氨基苯甲酸(?6.57 X 10—3mol)，繼續(xù)超聲30min ；將超聲后的溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，封閉反應(yīng)瓶，抽真空，充氮氣，加熱至70°C冷凝回流，磁力攪拌2h;反應(yīng)溶液離心，并用無水乙醇洗滌沉淀數(shù)次;沉淀物置于真空烘箱中干燥。
[0029]2.G0-3，5-DABA-聚苯胺(PANI)
[0030]稱取G0-3，5-二氨基苯甲酸0.3009g，加入60ml匪P混合，超聲分散；加入聚苯胺0.1509g，攪拌均勻；將0.071 Og過硫酸銨(?3.11 X 10-4mol)用1ml 1.0M鹽酸溶液溶解，緩慢滴加入反應(yīng)瓶;滴加完成后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h;將反應(yīng)溶液離心(5000rpm，5min)洗滌數(shù)次，沉淀置于真空烘箱中干燥。
[0031 ] 3.G0-3，5-DABA-PAN1-黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)
[0032]稱取G0-3，5-DABA-PANI20mg，用20ml pH = 5.27PBS緩沖液溶解，加入0.1156gNHS( I.0mM)和0.2867g EDC( I.5mM)，攪拌30min ；離心(1000rpm，5min)，洗去未反應(yīng)的EDC和NHS ；所得活化產(chǎn)物用pH = 7.4的PBS緩沖液稀釋至5ml，超聲5min ；稱取1mg FAD加入，攪拌過夜;離心洗滌，真空干燥。
[0033]4.G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-氯化血紅素(Hemin)
[0034]將G0-3，5-DABA-PAN1-FAD取1mg，用pH= 5.27PBS緩沖液溶解稀釋至1ml ；加入
0.0577g NHS(0.5mM)和0.1435g EDC(0.75mM)，攪拌30min;稱取5mg Hemin加入，攪拌過夜;
離心洗滌，并真空干燥。
[0035]5.還原 G0-3，5-DABA-PAN1-FAD-Hemin
[0036]取5mgGO-3,5-DABA-PAN1-FAD-Hemin以pH = 7.4PBS緩沖液溶解至5ml，量取20ml80 %水合肼加入，攪拌反應(yīng)4h;離心洗滌除去水合肼，真空干燥待用。
[0037]6.雙酶反應(yīng)體系的構(gòu)建一葡萄糖氧化酶(GOD)+辣根過氧化物酶(HRP)
[0038]取已還原GO-3,5-DABA-PAN1-FAD-Heminlmg，溶解于Iml pH = 7.4PBS緩沖液，分別取Iml lmg/ml去輔基的GOD(apo-GOD)和Iml lmg/ml去輔基的HRP(apo-HRP)加入，攪拌反應(yīng)30min，存放于4°C條件下待用。
[0039]活性測試:
[0040]1.GOD-HRP雙酶體系與GOD單酶體系活性對比[0041 ] 1.1PANI (I): Mw = 5400，Mn = 4000
[0042]共酶體系加入G0D:HRP = 1: l(lmg/ml);底物為50mM葡萄糖溶液。循環(huán)伏安法(CV)檢測范圍為O?0.8V，初步測定活性最佳提高4.24倍，如圖1所示，
[0043]1.2PANI(氯仿):Mw = 6300，Mn = 4100
[0044]共酶體系加入G0D:HRP = 1: l(lmg/ml);底物為50mM葡萄糖溶液。循環(huán)伏安法(CV)檢測范圍為O?0.8V，初步測定活性最佳提高3.62，如圖2所示。
[0045 ] 2.不同enzyme固定法電化學(xué)活性對比
[0046]所測