一種受體阻滯藥的個體化用藥檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種受體阻滯藥的個體化用藥檢測試劑盒， 具體涉及一種ADRB1基因多態(tài)性的檢測試劑盒及其構(gòu)成的反應(yīng)體系。
【背景技術(shù)】
[0002] β腎上腺素受體(β-adrenergic receptor)為腎上腺素受體的一個亞家族，屬于G 蛋白偶聯(lián)受體超家族，包含m、β2和β3三種不同亞型。該類受體通過與Gs蛋白偶聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞 內(nèi)cAMP和L型Ca2 +通道的開放頻率，是β受體激動劑和β受體阻滯劑的作用靶點(diǎn)。 ADRBlGly389Arg(rsl801253)多態(tài)性位點(diǎn)的出現(xiàn)，會導(dǎo)致Arg389和Gly389兩種類型受體的 產(chǎn)生，而研究者們已經(jīng)證實(shí)Arg389型受體與G蛋白偶聯(lián)效率要明顯高于Gly389型受體，所以 如果高血壓患者攜帶Arg389純合子基因，則會對降血壓藥物美托洛爾獲得比Gly389型受體 型患者更為明顯的療效，因此CFDA在2015年公布的《藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測 技術(shù)指南(試行）》中指出："Arg389純合子基因型心衰患者應(yīng)用卡維地洛和美托洛爾治療后 左室射血分?jǐn)?shù)改善情況更佳。建議臨床醫(yī)師在應(yīng)用β?受體阻滯藥前進(jìn)行ADRB1多態(tài)性檢測， 并根據(jù)其基因型調(diào)整用藥劑量，以提高療效，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。"
[0003] 目前ADRB1基因多態(tài)性的檢測產(chǎn)品主要應(yīng)用傳統(tǒng)固相芯片，液相芯片以及熒光定 量PCR等，這些技術(shù)手段均不同程度存在成本高，周期長以及假陽性率高等缺陷。因此，建立 一種檢測通量高，操作簡便且價格低廉的ADRB1基因多態(tài)性檢測試劑盒就變得十分重要。環(huán) 介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是日本科學(xué)家于2000年提出的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其主要特點(diǎn) 是針對革巴基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的 作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生109-101()數(shù)量級的產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后通過肉 眼直接觀察體系狀態(tài)的改變來判定待測樣本的基因型，無需開管，因此大大簡化了操作步 驟，同時又可以有效避免樣本交叉污染，而且，僅需普通水浴鍋即可開展檢測，又節(jié)約了大 量的檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服上述方法的缺陷，提供一種受體阻滯藥的個體化用藥檢測試劑 盒，具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 第一方面，一種受體阻滯藥的個體化用藥檢測試劑盒，所述試劑盒包括檢測引物 組，所述檢測引物組如下：
[0007] 正向外側(cè)引物F3:SEQ ID N0:1:GCCAACGTGGTGAAGGC;
[0008] 反向外側(cè)引物B3:SEQ ID N0:2:AGACAGCCCGAGGCG;
[0009] 正向內(nèi)側(cè)引物FIP:SEQ ID N0:3:TTGGCGTAGCCCAGCCAGACCGCGAGCTGGTGC;
[0010] 反向內(nèi)側(cè)引物BIPC:SEQ ID N0:4:CGTCTGCTCTGCTGCGCGGGCCGGTCTCCGTGG;
[0011] 反向內(nèi)側(cè)引物BIPT:SEQ ID N0:5:GGTCTGCTCTGCTGCGCGGGCCGGTCTCCGTGG。
[0012] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO:卜4所示的序列是用于檢測rsl801253位點(diǎn)的C等位基因。 [0013] 優(yōu)選地，所述SEQIDN0:l-3和SEQIDN0:5所示的序列是用于檢測rsl801253位 點(diǎn)的G等位基因。
[0014]本發(fā)明中，4條引物的外側(cè)引物記為正向外側(cè)引物F3和反向外側(cè)引物B3，內(nèi)側(cè)引物 記為正向內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包含了 Flc和F2，BIP包含了 Blc和B2。本 發(fā)明在普通LAMP的基礎(chǔ)上，以特異性要求最嚴(yán)格的Flc或Blc的5'端針對rsl801253位點(diǎn)設(shè) 計(jì)等位基因特異引物，分別檢測rsl801253的C等位基因和rsl801253的G等位基因。通過分 別在BIPC和BIPG的5'端第三位引進(jìn)額外的突變，進(jìn)一步降低非特異性擴(kuò)增的可能性。
[0015]優(yōu)選地，所述反應(yīng)體系還包括反應(yīng)緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍(lán)，甜菜堿，Bst DNA聚 合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。
[0016]優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0017] 第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的檢測試劑盒構(gòu)建的檢測反應(yīng)體系，所述 反應(yīng)體系包括第一方面所述的引物組，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍(lán)，甜菜堿，Bst DNA聚 合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。
[0018] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KC1，（NH4)2S〇4，MgS〇4和Tween-20。
[0019] 優(yōu)選地，所述Tris-HCl 的濃度為 10-30mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、13mM、 15禮、161111、181111、2〇1111、22111]\1、23111]\1、25111]\1、261111、281111或3〇1111，優(yōu)選為15-251111，進(jìn)一步優(yōu)選為 20mM〇
[0020] 優(yōu)選地，所述 KC1 的濃度為 10-60mM，例如可以是 10mM、llmM、12mM、15mM、20mM、 25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、46mM、48mM、50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、57mM、58mM、 59mM或60mM，優(yōu)選為50-55mM，進(jìn)一步優(yōu)選為50mM。
[0021 ]優(yōu)選地，所述（NH4)2S〇4 的濃度為 5-13mM，例如可以是 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、 1 OmM、1 ImM、12mM 或 13mM，優(yōu)選為 8-12mM，進(jìn)一步優(yōu)選為 1 OmM。
[0022] 優(yōu)選地，所述 MgS〇4 的濃度為 2-8mM，例如可以是 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mMS8mM， 優(yōu)選為2_6mM，進(jìn)一步優(yōu)選為4mM。
[0023] 優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分?jǐn)?shù)為0 · 1-1 %，例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、 0·4%、0·5%、0·6%、0·7%、0·8%、0·9%或1%，優(yōu)選為0.1%。
[0024] 優(yōu)選地，所述dNTPs的濃度為 1 -2mM，例如可以是 ImM、1 · ImM、1 · 2mM、1 · 3mM、1 · 4mM、 1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM 或2mM，優(yōu)選為 1.2-1.8mM，進(jìn)一步優(yōu)選為 1.4mM。
[0025] 優(yōu)選地，所述羥基萘酚藍(lán)的濃度為108-130μΜ，例如可以是108μΜ、109μΜ、110μΜ、 111卩]?、1124]\1、1154]\1、1164]\1、1184]\1、12(^]\1、1224]\1、1254]\1、1264]\1、1284]\1或13(^]\1，優(yōu)選為115-123μΜ，進(jìn)一步優(yōu)選為120μΜ。
[0026] 優(yōu)選地，所述甜菜堿的濃度為0-1Μ，例如可以是0Μ、0.2Μ、0.4Μ、0.5Μ、0.6Μ、0.7Μ、 0 · 8Μ、0 · 9Μ或1Μ，優(yōu)選為0 · 5-0 · 8Μ，進(jìn)一步優(yōu)選為0 · 8Μ。
[0027] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述反應(yīng)體系包括反應(yīng)體系C和反應(yīng)體系G，其中每個25yL反 應(yīng)體系含有以下組分：
[0028] 緩沖液：
[0031] 第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的反應(yīng)體系的使用方法，所述方法包 括如下步驟：
[0032] 將反應(yīng)體系C和反應(yīng)體系G所需各組分混合完畢，放置于恒溫水浴鍋進(jìn)行反應(yīng)，反 應(yīng)后升溫進(jìn)行滅活處理，再根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果。
[0033] 優(yōu)選地，所述恒溫水浴鍋的溫度為55-70°C，例如可以是55°C、56°C、57°C、58°C、59 °(3、60°(3、61°(3、62°(3、63°(3、64°(3、65°(3、68°(3或70°(3，優(yōu)選為58-61°(3，進(jìn)一步優(yōu)選為60°(3。
[0034] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)時間為15_90min，例如可以是15min、16min、18min、20min、 25min、30min、35min、40min、45min、50min、51min、52min、53min、55min、56min、58min、 60min、61min、62min、64min、65min、70min、75min、80min、85mir^90min，tfci￡*55-62min， 進(jìn)一步優(yōu)選為60min。
[0035] 優(yōu)選地，所述根據(jù)體系顏色變化判定結(jié)果為：
[0036] 反應(yīng)體系C為天藍(lán)色，反應(yīng)體系G為紫羅蘭，則待測位點(diǎn)基因型為CC;
[0037] 反應(yīng)體系C為紫羅蘭，反應(yīng)體系G為天藍(lán)色，則待測位點(diǎn)基因型為GG;
[0038] 反應(yīng)體系C為天藍(lán)色，反應(yīng)體系G為天藍(lán)色，則待測位點(diǎn)基因型為CG。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0040] (1)本發(fā)明試劑盒步驟簡單:擴(kuò)增DNA只需反應(yīng)體系配置完畢后放置在恒溫水浴鍋 中進(jìn)行反應(yīng)即可，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性及類似于PCR循環(huán)反應(yīng)中的反復(fù)變性、退 火、延伸等變溫過程；
[0041] (2)本發(fā)明試劑盒高特異性:應(yīng)用四條引物識別目的片段的六個區(qū)域，并且這六個 區(qū)域的順序、長短、退火溫度都有相應(yīng)要求，特異性很高，可以根據(jù)是否反應(yīng)就能判斷目標(biāo) 基因的存在與否，可應(yīng)用于遺傳背景相似的細(xì)菌或病毒的分型定性檢測；
[0042] (3)本發(fā)明試劑盒反應(yīng)快速、高效:整個反應(yīng)lh即可完成，且產(chǎn)率高；
[0043] (4)本發(fā)明試劑盒鑒定簡便:反應(yīng)完成后通過肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，結(jié) 果的觀察可以脫離凝膠成像的操作要求和儀器限制，加上反應(yīng)是等溫進(jìn)行，不用依賴PCR儀 復(fù)雜的循環(huán)溫度變化來完成，在水浴鍋中就能進(jìn)行，使該檢測試劑盒有著更廣闊的應(yīng)用前 景。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明試劑盒引物組的示意圖；
[0045]圖2為本發(fā)明試劑盒引物組中的FIP和BIP的示意圖；