培養(yǎng)，IPTG誘導4-12小時，收集菌液lmL，離心收集 菌體，1 X PBS洗滌一次，再懸浮于0.5mL 1 X PBS，超聲破碎菌體，離心去沉淀。
[0044] (3)取適量20yL上清與上樣緩沖液混合，95°C加熱變性10分鐘，離心收集至管底， 至于冰上。
[0045] (4)取10yL上樣15%聚丙烯酰胺電泳，考馬斯亮藍染色、脫色，觀察蛋白質條帶和 hFABP6蛋白的表達情況。
[0046] (5)重組hFABP6，包括N-HisTag、柔性接頭、多克隆區(qū)，共158aa，分子量17 · 2kDa。 hFABP6占菌體總蛋白的20 %，可溶性表達。
[0047] 實施例2
[0048] 1、MT4的全基因合成：
[0049] 合成的方法為通用的兩步PCR法(PCR，多聚酶鏈式反應），獲得MT4編碼DNA: 1)重疊 延伸PCR(0verlapPCR)以引物互為模板合成全長DNA序列，所用引物4條(SEQIDN0:23~ 26) ;2)并以此產(chǎn)物為模板，PCR擴增全長DNA，所用引物2條(SEQIDN0.27~28)。
[0050] (1)搭頭延伸PCR參數(shù):94°C/30秒，56°C/30秒，72°C/30秒，15個循環(huán)，補齊延伸72 °C/2分鐘。
[0051 ] (2)全長合成PCR參數(shù):94°C/30秒，58°C/30秒，72°C/45秒，30個循環(huán)，補齊延伸72 °C/5分鐘。
[0052] 2、hFABP6-MT4融合蛋白表達載體構建：
[0053] (1)將人工合成所獲得的MT4 DNA序列，分別經(jīng)過Kpn Ι/Xho I雙酶切處理、電泳、 切膠純化；
[0054] (2)同時將pET28-hFABP6載體用Kpn I/Xho I雙酶切處理、純化；
[0055] (3)用T4 DNA連接酶將經(jīng)過（1)和（2)處理的DNA片段分別連接，形成連接產(chǎn)物： pET28-hFABP6-MT4(SEQ ID N0.29)。
[0056] (4)將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌菌株BL21(DE3)，挑取單菌落，PCR法鑒定陽性 克隆，送交DNA序列分析，保留序列正確的pET28-hFABP6-MT4/BL21(DE3)克隆，保存菌種。 [0057] 實施例3
[0058] (一)對照載體pET28-MT4的構建
[0059] MT4 的 PCR引物，上游引物：5 ' -TTTTGGTACCATGGATCCGCGCGAATGTGTCTGCATGTCTG-3 ' (SEQ ID N0.27)，下游引物：5'-TTTTCTCGAGTTATGGACAGCAGGAGCATTTATC-3'（SEQ ID NO.28)。
[0060] PCR 參數(shù)是:94°C/30 秒，56°C/30 秒，72°C/30 秒，30 個循環(huán)。
[0061 ] (2)MT4PCR產(chǎn)物的限制性內切酶酶切
[0062] PCR產(chǎn)物用Ncol/Xhol雙酶切，電泳切膠純化。
[0063] 3 ·用Ncol/Xhol雙酶切處理pET28載體，電泳切膠純化。
[0064] 4.T4 DNA連接酶連接線性化pET28載體與插入片段MT4。
[0065] 5.將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)，挑取單菌落擴增鑒定重組子， 測序分析獲得正確的PET28-MT4克隆。
[0066] 6.取上述正確克隆，LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)增菌。
[0067] 7.取過夜培養(yǎng)物1:10接種于新鮮LB培養(yǎng)基，4小時后，或0D = 0.6，加 IPTG至0.1 mM， 繼續(xù)誘導12小時。
[0068] 8.取lmL培養(yǎng)物，離心收集菌體，PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸浮，超聲破碎，分別 保留上清和沉淀，沉淀物用0.5mL PBS再懸浮，分別取上清20yL，2x蛋白電泳緩沖液20yL，95 °C加熱10分鐘，冰上放置2分鐘，離心12000RPM，5分鐘，收集上清，留作聚丙烯酰胺凝膠電 泳。
[0069] 9.分別取10yL樣品上樣聚丙烯酰胺凝膠，電泳至染料前端到達凝膠的下1/3,收 膠，考馬斯亮藍染色、脫色。
[0070] 10.觀察有無 6.4kDa的表達條帶及條帶濃度（占總蛋白的比例）。
[0071] (二）pET28-hFABP6-MT4 的表達測試
[0072] (l)將pET28-hFABP6-MT4/BL21(DE3)的正確克隆過夜培養(yǎng)增菌；
[0073] (2)取過夜培養(yǎng)物1: 10接種于新鮮LB培養(yǎng)基，4小時后，或0D = 0.6,加 IPTG至 O.lmM，繼續(xù)誘導12小時。
[0074] (3)取lmL培養(yǎng)物，離心收集菌體，PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸浮，超聲破碎，分 別保留上清和沉淀，沉淀物用0.5mL PBS再懸浮，分別取上清20yL，2x蛋白電泳緩沖液20yL， 95°C加熱10分鐘，冰上放置2分鐘，離心12000RPM，5分鐘，收集上清，留作聚丙烯酰胺凝膠電 泳。
[0075] (4)分別取10yL樣品上樣聚丙烯酰胺凝膠，電泳至染料前端到達凝膠的下1/3,收 膠，考馬斯亮藍染色、脫色。
[0076] (5)觀察有無約22.6kDa的表達條帶及條帶濃度，結果見下表。
[0077] 表1. MT4在兩種不同表達載體中的表達狀況
【主權項】
1. 一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的人類金屬硫蛋白融合 蛋白表達載體是將人類金屬硫蛋白-4的編碼序列作為目標蛋白插入伴侶樣蛋白的融合蛋 白表達載體的多克隆區(qū)所得;所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體上游含有人類游離脂 肪酸結合蛋白-6的編碼序列，人類游離脂肪酸結合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭區(qū) 和用于插入目標蛋白的多克隆區(qū)。2. 根據(jù)權利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的人類 游離脂肪酸結合蛋白-6與人類天然游離脂肪酸結合蛋白的同源性等于或大于85 %，人類游 離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼序列。3. 根據(jù)權利要求2所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的人類 游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列如SEQIDNO. 1所示。4. 根據(jù)權利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的柔性 接頭區(qū)和多克隆區(qū)編碼序列如SEQIDNO.3所示。5. 根據(jù)權利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的人類 金屬硫蛋白-4其氨基酸序列與人類天然金屬硫蛋白的氨基酸序列的同源性等于或大于 75%。6. 根據(jù)權利要求5所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:人類金屬硫 蛋白-4氨基酸序列如SEQIDNO.22所示。7. 根據(jù)權利要求6所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:人類金屬硫 蛋白-4編碼序列如SEQIDNO.21所示。8. 根據(jù)權利要求1所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的表達 載體中人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼用于分離純化融合蛋白 的標簽的序列。9. 根據(jù)權利要求8所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，其特征在于:所述的表達 載體中人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼組氨酸標簽的序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人類金屬硫蛋白-4融合蛋白表達載體。所述表達載體克隆區(qū)的上游包含人類脂肪酸結合蛋白(hFABP6)，下游為金屬硫蛋白MT4。本發(fā)明還揭示了應用所述表達載體的方法，包括表達菌株的構建、擴增、誘導表達、融合蛋白純化的基本方法。本發(fā)明所揭示的hFABP6-MT4融合蛋白表達載體具有如下特點：①高效表達MT4蛋白；②可溶性表達。
【IPC分類】C12N15/70
【公開號】CN105441472
【申請?zhí)枴緾N201510976807
【發(fā)明人】李萬波, 陜婧婧, 盧嬋
【申請人】盤古基因生物工程(南京)股份有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月22日