狂犬病病毒組合物和方法
【專利說明】
[0001 ] 本申請是國際申請日2006年10月13日、國際申請?zhí)朠CT/US2006/040134于2008年4 月14日進入中國國家階段、申請?zhí)?00680038314.4、發(fā)明名稱"狂犬病病毒組合物和方法" 的申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請的參考
[0003] 本申請要求享有2005年10月14日提交的美國臨時申請60/727,038的優(yōu)先權(quán)，在此 完整引入作為參考。
[0004] 政府支持的聲明
[0005] 本發(fā)明由美國政府機構(gòu)，疾病控制和預(yù)防中心（Centers for Disease Control and Prevention)做出。因此，美國政府在本發(fā)明中享有確定的權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本公開涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本公開涉及可用于保護哺乳動物免受狂犬病 病毒感染的組合物和用于生產(chǎn)免疫原性組合物的方法。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 狂犬病仍然是感染人類和動物的最可怕的傳染性疾病之一，盡管在其預(yù)防和控制 方面已取得顯著的科學(xué)進展。在世界不同地區(qū)，狂犬病表現(xiàn)為不同的問題。在美國，狂犬病 儲存宿主存在于許多野生動物種類中，包括浣熊、臭鼬、狐貍和蝙蝠（Rupprecht等人， Emerg. Infect.Dis. 1(4): 107-114,1995)。在橫跨美國的廣大地理區(qū)域發(fā)現(xiàn)了狂犬病傳染 在這些陸生哺乳動物中的爆發(fā)。例如，浣熊狂犬病影響從佛羅里達州到緬因州超過1百萬平 方公里的區(qū)域。盡管發(fā)達國家仍然存在野生動物狂犬病，但利用野生動物的口服免疫在控 制和消除野生動物狂犬病方面已經(jīng)取得進展。
[0009] 盡管如此，狂犬病仍然是對公共衛(wèi)生的一種主要威脅，每年持續(xù)造成50，000至60， 000人死亡(世界衛(wèi)生組織，2003年4月）。人類主要是通過被患有狂犬病的家養(yǎng)或者野生動 物咬傷而感染狂犬病病毒。在發(fā)展中國家，狗導(dǎo)致大約94%的人類狂犬病死亡。在非洲、亞 洲和南美洲的大多數(shù)國家狗，狂犬病仍然是動物流行性的，并且在這些國家中，狗導(dǎo)致該疾 病引起的大部分人類死亡。因此，控制家養(yǎng)和野生動物中的狂犬病病毒感染不僅降低這些 動物的死亡率而且降低人類接觸的風(fēng)險。
[0010] 狂犬病病毒通過被感染動物的咬傷或者抓傷造成的破裂皮膚傳送。接觸狂犬病病 毒導(dǎo)致其滲透入外周、無髓鞘的神經(jīng)末梢，繼而通過逆向軸突運輸傳播，復(fù)制只在神經(jīng)元中 發(fā)生，并最后到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNShCNS的感染造成細胞機能障礙和死亡(Ruppr eCht& Dietzschold，Lab Invest. 57:603，1987)。因為狂犬病病毒直接從細胞傳播到細胞，它基本 上逃脫了免疫識別（Clark&Prabhakar，Rabies，In:01son等人，eds.，Comparative Pathology of Viral Disease,2:165,Boca Raton，F(xiàn)L，CRC Press，1985)〇
[0011] 狂犬病病毒(RV)是一種彈狀病毒-一種具有陰性有義極性的非節(jié)段RNA病毒。在彈 狀病毒科(Rhabdoviridae)家族中，狂犬病病毒是狂犬病毒(Lyssavirus)屬的原型。RV由兩 個主要結(jié)構(gòu)成分構(gòu)成:核衣殼或者核糖核蛋白（RNP)，和圍繞RNP核的雙層膜形式的被膜。所 有彈狀病毒的感染性成分是RNP核，由負鏈RNA基因組組成，所述負鏈RNA基因組被核蛋白 (N)結(jié)合RNA依賴性RNA聚合酶(L)和磷蛋白（P)包裝。環(huán)繞RNP的膜包含兩種蛋白：跨膜糖蛋 白（G)和基質(zhì)(M)蛋白，位于膜內(nèi)部位置。因此，病毒基因組編碼這5種蛋白：RNP中的3種蛋白 (N，L和P)，基質(zhì)蛋白（M)，和糖蛋白（G)。
[0012] 不同狂犬病病毒株致病性的分子決定簇還沒有被完全闡明。RV致病性歸因于多基 因事件(Yamada等人，Microbio 1. Immunol. 50:25-32，2006)。例如，RV基因組中的一些位置 如果突變，則影響病毒轉(zhuǎn)錄或者復(fù)制，減輕毒性。N基因磷酸化位點的絲氨酸殘基389處(Wu 等人，J. Virol. 76:4153-4161,2002)或者L基因高度保守的C模體的⑶N核心序列（Schnell 和Conzelmann，Virol · 214:522-530，1995)的突變，顯著降低RV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。
[0013] G蛋白，還稱為刺突蛋白，參與RV的細胞粘附和膜融合。已經(jīng)鑒定G蛋白330到340位 的氨基酸區(qū)域(稱為抗原部位III)對RV某些株的毒性重要。數(shù)個研究支持以下觀點，即固定 RV株的致病性由糖蛋白氨基酸殘基333處存在的精氨酸或者賴氨酸決定(Dietzschold等 人，Proc. Natl .Acad. Sci. USA 80 :70-74,1983; Tuffereau 等人，Virol · 172:206-212， 1989)〇
[0014] 這種現(xiàn)象似乎至少適用于固定的狂犬病病毒例如(^3 31^，？￥，340-819和!??-Flury株（Anilionis等人，Nature 294:275-278,1981 ;Morimoto等人，Virol · 173:465-477， 1989)。例如，具有不同于糖蛋白333位Arg的氨基酸的狂犬病疫苗病毒描述于，例如，W0 00/ 32755(描述RV突變體，其中與親代病毒相比，G蛋白Arg333密碼子的所有3種核苷酸都被改 變，因此333位Arg被另一種氨基酸取代）；歐洲專利350398(描述無毒力的RV突變體SAG1，來 自RV的Bern SAD株，其中糖蛋白333位的Arg已經(jīng)被替換為Ser);和歐洲專利申請583998(描 述減毒的RV突變體，SAG2，其中G蛋白333位的Arg被Glu替換）。
[0015] 其他株，例如RC-HL株，在G的333位具有精氨酸殘基，但在成年小鼠中不造成致命 感染（Ito等人，Microl. Immunol .38 :479-482,1994; Ito等人，J. Virol .75: 912卜9128， 2001)。因此，整個G可能有助于RV的毒性，盡管決定簇或者區(qū)域之前還沒有被鑒定。G基因編 碼誘導(dǎo)病毒中和抗體的唯一蛋白。已知RV糖蛋白的至少3種狀態(tài):負責(zé)受體結(jié)合的天然狀態(tài) (N);膜融合過程初始步驟必需的活性疏水狀態(tài)(A)(Gaudin，J.Cell Biol. 150:601-612, 2000)，和融合無活性構(gòu)象（Ι)Χ的正確折疊和成熟在免疫識別中起著重要作用。ERA G胞外 結(jié)構(gòu)域中3個潛在糖基化位置分別存在于Asn37，Asn247和Asn 319殘基（Wojczyk等人， Glycobiology. 8:121-130，1998) X的非糖基化不僅影響構(gòu)象，而且抑制蛋白在細胞表面的 呈遞。因此，闡明導(dǎo)致狂犬病病毒致病性的分子決定簇提出了一個復(fù)雜的問題。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 此處公開了對應(yīng)于狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)固定疫苗的病 毒株的完整序列，以及對其和狂犬病病毒屬其他株進行測序的方法。
[0018]還描述了狂犬病病毒的反向遺傳系統(tǒng)，尤其是利用狂犬病病毒株ERA作為不范。 T7RNA聚合酶的使用促進病毒復(fù)原，所述T7RNA聚合酶在N末端包含一個八氨基酸核定位信 號(NLS)。除未代ERA病毒株外，還描述了數(shù)種其他衍生病毒，包括ERA-(缺失psi-區(qū)域）， ERAgreenl (在psi-區(qū)域插入綠色焚光蛋白基因），ERAgreen2(在磷蛋白和基質(zhì)蛋白基因間 區(qū)域插入綠色熒光蛋白），ERA2g(在psi-區(qū)域包含糖蛋白的額外拷貝），ERAg3(在糖蛋白氨 基酸333處有突變），ERA2g3(在psi-區(qū)域氨基酸333處具有改變的糖蛋白的額外拷貝），ERA- G(其中已經(jīng)刪除糖蛋白），ERAgm(M和G基因在基因組中互換），和ERAgmg(重排的ERAgm構(gòu)建 體中G的兩個拷貝）。額外轉(zhuǎn)錄單位被整合入ERA病毒基因組用于開放閱讀框(ORF)的有效表 達。通過優(yōu)化此處描述的繁殖條件，在生物反應(yīng)器或者固定的組織燒瓶中恢復(fù)病毒的滴度 達到超過10 9ffu/mL。
[0019] 還公開了一種組成性表達ERA糖蛋白的改造細胞系。該細胞系，命名為BSR-G，用于 重組的，包括減毒和/或復(fù)制缺陷的，狂犬病病毒的制備。
[0020] 根據(jù)下列詳細說明，本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和優(yōu)點將更顯而易見。
[0021 ] 附圖簡述
[0022 ]圖1A. ERA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的示意圖。錘頭核酶和反基因組ERA基因組的位置如圖解所示。 按5'到3'方向顯示N，P，M G和L蛋白的相對位置。
[0023] 圖1B.構(gòu)建全長ERA狂犬病病毒基因組cDNA質(zhì)粒pTMF的示意圖。RT-PCR產(chǎn)物F1、F2 片段，和限制性酶識別位點(Nhel ,ΚρηΙ，Blpl，Pst和Notl)(未按比例繪制）。左邊的條顯示 RdRz-錘頭核酶，右邊的條顯示HDVRz-丁型肝炎病毒核酶。符號?表示Kpnl或者Pstl位點被 刪除，丨垂直箭頭表示Nhel或者Notl位點仍是完整的。
[0024]圖2.通過pNLST7質(zhì)粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用設(shè)想機理的示意圖。DNA轉(zhuǎn) 染試劑復(fù)合物通過胞吞作用攝入細胞。從溶酶體和內(nèi)體釋放的大部分DNA保留在細胞的細 胞質(zhì)中。有限量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細胞核：1)通過CMV立即早期啟動子，NLST7基因通過細胞RNA 聚合酶Π 轉(zhuǎn)錄;2)成熟的NLST7mRNA從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)用于NLST7RNA聚合酶合成;3)新 合成的NLST7RNA聚合酶轉(zhuǎn)移到細胞核，而痕量NLST7保留在細胞質(zhì)中；4)NLST7RNA聚合酶通 過PT7啟動子起始轉(zhuǎn)錄。通過轉(zhuǎn)錄后修飾，產(chǎn)生額外的NLST7mRNA用于蛋白合成，從而提高病 毒恢復(fù)效率。
[0025]圖3. 10種衍生ERA病毒基因組的示意圖。各基因的大小不是按比例繪制。符號 標(biāo)明在Aa333殘基處G的突變，Ψ是Psi-區(qū)域。
[0026]圖4A.轉(zhuǎn)染細胞中回收的ERA-G病毒，在BHK-G細胞系中傳播和生長的分析。在A中， 甚至在以用于病毒恢復(fù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的7天后，ERA-G病毒病灶仍被抑制。在B中，在正常BSR 細胞中傳代后，恢復(fù)的ERA-G病毒不傳播。只有個別細胞被DFA染色。在C中，ERA-G病毒在組 成型BHK-G細胞系中生長良好。
[0027]圖4B.BHK-G細胞系中G表達的分析。通過間接熒光染色法，ERA狂犬病病毒G在穩(wěn)定 的細胞系BHK-G的細胞質(zhì)中表達。
[0028] 圖4C.利用G探針，通過Northern印跡對ERA-G病毒感染細胞中G mRNA的分析。第2 道顯示在ERA-G病毒感染的BHK-G細胞中檢測到G基因 mRNA，而未檢測到病毒基因組RNA。第1 道是ERA-狂犬病病毒感染的BHK-G細胞的總RNA對照，其中G mRNA和病毒基因組RNA均被檢 測到。
[0029] 圖5.單步病毒生長曲線所有恢復(fù)狂犬病病毒ERA株生長到109或者101()ffu/mL，但 ERA-G 只達到 107ffu/mL。
[0030] 圖6.ERAgreenl/ERAgreen2狂犬病病毒感染的BSR細胞中的綠色病灶Transl是在 Psi和L基因間區(qū)域整合的翻譯單位。Trans2是在P和Μ基因間區(qū)域的翻譯單位。ERAgreen2和 ERAgreenl均在病毒感染的BSR細胞中穩(wěn)定表達GFP蛋白，而病毒感染后ERAgreen2綠色病灶 的出現(xiàn)比在ERAgreenl中早48小時。
[0031 ]圖7.在雙G，和G、M重排的ERA-狂犬病病毒中G mRNA表達的分析。在利用G探針的 Northern印跡中，與ERA-病毒感染的細胞(第2道)相比，對ERA2g(第1道）、ERAgm(第3道)和 ERA2g3(第4道）中G mRNA光密度的測量顯示增強的mRNA水平。利用ERA-病毒作為100%，計 算比例。
[0032]圖8A.通過體內(nèi)接種重組ERA和衍生物誘導(dǎo)的發(fā)病率。三周齡小鼠肌內(nèi)接種8種恢 復(fù)病毒。在接種后10天，在ERA、ERA-和ERAgreenl組中，50%、50%和20%的小鼠分別顯示狂 犬病的相應(yīng)臨床癥狀，但沒有死亡。其他組中沒有觀察到不良征象。
[0033]圖8B.接種重組ERA和衍生物的小鼠中攻擊后的存活率。從圖8A中所示的試驗中存 活的小鼠用Texas犬/山狗狂犬病病毒進行肌內(nèi)攻擊。在攻擊后5天，在ERA和ERA-組中，40和 62%的小鼠分別顯示狂犬病征象并被處安樂死。在所有其他組中，沒有觀察到狂犬病征象。 [0034]圖8C.腦內(nèi)接種重組ERA和ERAg3病毒后的存活。三周齡小鼠分別腦內(nèi)接種ERA和 ERAg3病毒株。ERA組中所有小鼠在接種后15天死亡，而在ERAg3組中，所有小鼠都存活，沒有 臨床癥狀。
[0035]圖8D.乳鼠腦內(nèi)接種后的存活。兩日齡的乳鼠分別腦內(nèi)接種ERAg3和ERA-G病毒構(gòu) 建體。ERAg3組中所有小鼠死亡，而ERA-G組中沒有小鼠死亡。
[0036]圖8E.接種重組ERA和衍生病毒的小鼠的中和抗體滴度。利用RFFIT測定小鼠中和 抗體滴度，在病毒接種組中范圍從每ml 1.36到5.61 IU。
[0037]圖9A.感染Albania蝙蝠狂犬病病毒后的存活。倉鼠接種活的Albania蝙蝠狂犬病病 毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進行接觸后處理。 在超過3個月期間進行存活評定。
[0038]圖9B.感染Thai Street犬狂犬病病毒后的存活。倉鼠接種活的Albania蝙蝠狂犬病 病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進行接觸后處 理。在超過3個月期間進行存活評定。
[0039] 圖9C.感染Texas山狗狂犬病病毒后的存活率。倉鼠接種活的Albania蝙蝠狂犬病病 毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進行接觸后處理。 在超過3個月期間進行存活評定。
[0040] 序列表
[0041 ]如37C. F. R. 1.822所定義，利用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸3字母編碼， 顯示所附序列表中所列的核酸和氨基酸序列。每個核酸序列只顯示一條鏈，但應(yīng)當(dāng)理解為 通過任意參考所顯示的鏈，還包括互補鏈，除非上下文明確表示只意在一條鏈。適當(dāng)?shù)脑拺?yīng) 理解，通過用尿嘧啶取代硫胺殘基，表示為DNA的序列可以轉(zhuǎn)換為RNA。
[0042] SEQ ID NO: 1 .ERA CDC野生型病毒，11,931 個核苷酸 [0043] 1-58核苷酸，前導(dǎo)區(qū)
[0044] 71-1420核苷酸，N基因
[0045] 1514-2404核苷酸，P 基因
[0046] 2496-3101 核苷酸，M 基因
[0047] 3317-4888 核苷酸，G 基因
[0048] 4964-5362 核苷酸，Psi-區(qū)域
[0049] 5417-11797 核苷酸，L 基因
[0050] 11862-11931 核苷酸，Trailer 區(qū)
[0051] SEQ ID N0:2.ERACDC:71到1420:450aa，N蛋白·
[0052] SEQ ID 恥：3』1^〇)(：:1514到2404:297&&，？蛋白·
[0053] SEQ ID N0:4.ERACDC:2496到3101:202aa，M蛋白·
[0054] SEQ ID N0:5.ERACDC:3317到4888:524aa，G蛋白·
[0055] SEQ ID N0:6.ERACDC:5417to 11797:2127aa，L蛋白·
[0056] SEQ ID N0:7.通過反向遺傳系統(tǒng)恢復(fù)的重組ERA(rERA)有11,930個核苷酸。在重 組ERA反向遺傳系統(tǒng)中，野生型ERA株中G基因和psi-區(qū)之間的特異性poly (As) tract被突變 為poly (A7) tract，作為序列標(biāo)記物。因此，rERA比野生型ERA少一個核苷酸。所有其他序列 ?目息都是完全相同的。
[0057] SEQ ID N0:8.ERAg3株（11,930個核苷酸），G蛋白中的氨基酸（333Aa)已經(jīng)改變;相 應(yīng)的核酸在4370到4372位。
[0058] SEQ ID N0:9.ERA-(11，577個核苷酸），無 psi(假-基因）區(qū)；額外轉(zhuǎn)錄單位已經(jīng)導(dǎo) 入核苷酸4950到5008位。
[0059] SEQ ID ^):10』1^-26(13，150個核苷酸），該株具有6基因的兩個拷貝；第二個拷 貝在4988到6559位插入。
[0060] SEQ ID勵：11上1^8代611(12,266個核苷酸），該株在4993到5673位包含6??的編碼 序列;細胞或者組織感染后在紫外光下顯示綠色。
[0061] SEQ ID從)：12上1^-6(10,288個核苷酸），該株不含6基因。
[0062] SEQ ID勵:13上1^-283(13，150個核苷酸）；該株具有6基因的兩個拷貝（其中第二 個在4988到6559位），兩個均是在氨基酸333被取代（對應(yīng)于所示序列中核苷酸位置4370-4372和6041-6043)。
[0063] SEQ ID如：14上1^1七（11，976個核苷酸，？基因后2469到2521位處具有一個額外 的轉(zhuǎn)錄單位）。
[0064] SEQ ID如：15』1^1卜6??(12,662個核苷酸，在？基因后2505到3185位插入6卩?基 因）。
[0065] SEQ ID N0:16.ERAgm(ll，914個核苷酸)G和Μ基因的位置分別與G在2505-4076位 和Μ在4122-4727位互換。
[0066] SEQ ID勵：17上1^83111(11，914個核苷酸)6和]\1基因的位置分別與6在2505-4076位 和Μ在4122-4727位互換。G基因在氨基酸333位突變。
[0067] SEQ ID Ν0:18.ERAgmg( 13,556個核苷酸），該株在2505-4076位和4943-6514位具 有G基因的兩個拷貝，在4122-4727位側(cè)翼帶有Μ基因。
[0068] SEQ ID Ν0:19.錘頭核酶的前10個核苷酸對應(yīng)于狂犬病病毒ERA基因組的5'端。 [0069] SEQ ID從):20.核苷酸序列編碼3￥401'抗原核定位信號(13)。
[0070] SEQ ID NO :21-23.人工Kozak序列。
[0071] SEQ ID NO:24-57.合成寡核苷酸。
[0072] SEQ ID N0:58.在氨基酸333位突變的G蛋白的氨基酸序列(從Arg到Glu)。
[0073] SEQ ID NO :59-65.合成寡核苷酸。
[0074] 具體內(nèi)容
[0075] I.介紹
[0076] 病毒性人畜共患病很難預(yù)防。一種主要范例是通過口服免疫控制野生動物狂犬 病。所有當(dāng)前得到許可的口服狂犬病疫苗基于一個共同來源<^￥6 1711-1?〇1^1：11；^1^-Abelseth(ERA)的固定狂犬病病毒(RV)來源于Street-Alabama-Dufferin(SAD)株，1935 年 首先從阿拉巴馬(USA)的一條瘋狗中分離。在小鼠腦、幼倉鼠腎(BHK)細胞和雞胚中進行SAD RV的多次傳代后，獲得ERA株。ERA在BHK細胞中的重復(fù)克隆最終獲得B-19克隆，其被命名為 SAD-B19,用于疫苗研究。通過反向遺傳恢復(fù)的第一個RV株是SAD-B19。盡管SAD-B19和ERA RV來自相同來源，但是在不同動物的口服疫苗研究中觀察到不同的結(jié)果。例如，ERA在臭鼬 或者浣熊中口服不誘導(dǎo)明顯的中和抗體，而SAD-B19誘導(dǎo)。為了闡明這兩種RV株之間的潛在 差異，需要一種用于ERA RV株的反向遺傳系統(tǒng)。
[0077]反向遺傳學(xué)提出了一種按照指定路線修飾RNA病毒的可行途徑。一種用于狂犬病 病毒原始株的反向遺傳系統(tǒng)在1994年成功建立(Schnell等人，The EMBO J. 13,4195-4203， 1994)。在十年間，已經(jīng)對該系統(tǒng)作出改進，導(dǎo)致病毒恢復(fù)的效率增加。這種增加的效率有助 于闡明病毒致病性、蛋白-蛋白以及蛋白-RNA相互作用。
[0078] 在狂犬病病毒基因組內(nèi)，已經(jīng)認為一些區(qū)域包含重要的信號，例如病毒遠端啟動 子區(qū)，核蛋白包裝，RNA依賴性RNA聚合酶L轉(zhuǎn)錄起始位點，多腺苷酸化和終止位點。這些信號 對于確保病毒的有效恢復(fù)和設(shè)計額外的轉(zhuǎn)錄單位是非常重要的，所述額外轉(zhuǎn)錄單位用于將 外源的開放閱讀框(0RF)接納到狂犬病病毒基因組中。
[0079] 本公開提供一種有效的反向遺傳系統(tǒng)，并描述其產(chǎn)生ERA株病毒的變異體的用途。 此處描述的修飾獲得適合用于接納0RF表達和疫苗開發(fā)的候選株。
[0080] 反向遺傳系統(tǒng)由一組質(zhì)粒組成。第一種質(zhì)粒包括ERA病毒cRNA。為了在轉(zhuǎn)錄的病毒 cDNA中產(chǎn)生可靠的病毒反基因組末端，ERA基因組在cDNA3'端側(cè)翼為錘頭核酶，5'端側(cè)翼為 丁型肝炎病毒核酶。反基因組盒與細菌噬菌體T7轉(zhuǎn)錄起始信號融合，這還任選在巨細胞病 毒(CMV)立即早期啟動子的控制下。
[0081] 該系統(tǒng)還包括大量輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒編碼參與病毒包裝的蛋白。例如，該系 統(tǒng)通常包括編碼病毒核蛋白（N)、磷蛋白（P)、RNA依賴性聚合酶(L)、和任選的病毒糖蛋白 (G)的輔助質(zhì)粒。該系統(tǒng)還包