一種從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種提取γ -聚谷氨酸的方法，具體來(lái)說(shuō)是一種從發(fā)酵液中提取γ -聚谷氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ-聚谷氨酸是由微生物合成的一種水溶性胞外高分子多肽，相對(duì)分子量在10kD-1OOOkD之間，由于具有優(yōu)良的水溶性、超強(qiáng)的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無(wú)公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環(huán)境保護(hù)、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均有很大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值，但γ-聚谷氨酸發(fā)酵液粘稠，預(yù)處理成本過(guò)大，且傳統(tǒng)沉淀法會(huì)對(duì)γ-聚谷氨酸分子量造成破壞。雙水相體系由于其制備工藝簡(jiǎn)單、成本低、反應(yīng)溫和，在蛋白質(zhì)、酶類等生物活性成分的提取純化中應(yīng)用廣泛。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸的方法，所述的這種從發(fā)酵液中提取γ -聚谷氨酸的方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的γ -聚谷氨酸發(fā)酵液粘稠、預(yù)處理成本過(guò)大、傳統(tǒng)的沉淀法會(huì)對(duì)γ -聚谷氨酸分子量造成破壞的技術(shù)問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟:
[0005]I)—個(gè)制備混合溶液的步驟;所述的混合溶液由PEG1000、(NH4)2S04、發(fā)酵液和水組成，所述的發(fā)酵液由枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)液態(tài)發(fā)酵制得，發(fā)酵液的PH值為3.75-8.46，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 % -30 %、( NH4) 2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 % -25 %、發(fā)酵液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8-12%，余量為水；
[0006]2) —個(gè)自然分相的步驟，將制成的混合溶液靜置自然分相，控制溫度為20?40°C;
[0007]3)取步驟(2)混合溶液的上相，采用截留分子量為30KDa的超濾膜透過(guò)PEG1000，截留的γ -聚谷氨酸濃縮液經(jīng)-10?-20°c冷凍后，再于-40?-60°c真空冷凍干燥10-30h，即得純品。
[0008]進(jìn)一步的，步驟(I)中，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、(NH4)2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %、發(fā)酵液的pH值為3.75且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，余量為水;步驟(2)中控制溫度為20°C。
[0009]進(jìn)一步的，步驟(I)中，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、(NH4)2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %、發(fā)酵液的pH值為8.46且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水;步驟(2)中控制溫度為40°C。
[0010]進(jìn)一步的，步驟(I)中，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、(NH4)2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、發(fā)酵液pH值為5.31且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水;步驟(2)中控制溫度為30°C。
[0011]進(jìn)一步的，步驟(I)中，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,(NH4)2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、發(fā)酵液pH值為4.66且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水;步驟⑵中控制溫度為25°C。
[0012]進(jìn)一步的，步驟(I)中，在所述的混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 %、發(fā)酵液pH值為7.55且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水;步驟⑵中控制溫度為40°C。
[0013]進(jìn)一步的，采用上述方法所提取的γ-聚谷氨酸，其分配系數(shù)為0.81-2.31，提取率為45.06%-78.02%。
[0014]本發(fā)明利用發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物在兩相(PEG1000溶液、(NH4) 2S(k溶液)中溶解度的差異，在混合溶液中發(fā)酵液質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的條件下，通過(guò)改變兩相配比、發(fā)酵液PH值及外界溫度，使發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸能夠富集到含水量更高的上相PEG1000溶液中。上相中PEG1000及富集的γ-聚谷氨酸混合溶液，采用30kD的超濾膜透過(guò)小分子量的PEG1000，截留液中γ -聚谷氨酸被不斷濃縮，濃縮的γ -聚谷氨酸溶液經(jīng)低溫冷凍后，采用真空冷凍干燥制得y _聚谷氨酸純品。
[0015]本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明采用的雙水相技術(shù)，從發(fā)酵液中提取γ -聚谷氨酸解決了 γ -聚谷氨酸發(fā)酵液粘稠，預(yù)處理成本過(guò)大的問(wèn)題，同時(shí)，本發(fā)明的后續(xù)雙水相體系反應(yīng)溫和，避免了傳統(tǒng)沉淀法對(duì)γ -聚谷氨酸分子量的破壞。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明的雙水相技術(shù)從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸所用的發(fā)酵液由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis GIMl.286)液態(tài)發(fā)酵制得，發(fā)酵過(guò)程中的培養(yǎng)基配方(g/L)及培養(yǎng)條件如下:蛋白胨30，葡萄糖40，谷氨酸鈉30，氯化鈉15，磷酸氫二鉀2，磷酸二氫鉀4，硫酸鎂
0.5，氯化鈣0.25余量為水;發(fā)酵液pH值7.0-7.2，37°C，250r/min培養(yǎng)48h。
[0018]本發(fā)明的雙水相技術(shù)從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸所用的小型切向流超濾裝置，由美國(guó)Mi I Iipore公司生產(chǎn)。
[0019]實(shí)施例1
[0020]—種從發(fā)酵液中提取γ -聚谷氨酸的方法，通過(guò)包括如下步驟的方法制備而成:
[0021](I)、混合溶液制備；
[0022]混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、發(fā)酵液pH值為3.75且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水；
[0023](2)、自然分相；
[0024]將步驟(I)中制成的混合溶液靜置自然分相，控制環(huán)境溫度為20°C;
[0025 ] (3 )、取步驟(2)混合溶液的上相，采用截留分子量為30KDa的超濾膜透過(guò)PEG1000，截留的γ -聚谷氨酸濃縮液經(jīng)-15°C冷凍后，于_50°C真空冷凍干燥24h，即得純品。
[0026]上述所得的γ-聚谷氨酸雙水相體系，分配系數(shù)為0.93，提取率為51.25%。
[0027]實(shí)施例2
[0028]—種從發(fā)酵液中提取γ-聚谷氨酸的方法，通過(guò)包括如下步驟的方法制備而成:
[0029](I)、混合溶液制備；
[0030]混合溶液中，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、(NH4)2S04的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%、發(fā)酵液pH值為8.46且質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，余量為水；
[0031](2)、自然分相；
[0032]將步驟(I)中制成的混合溶液靜置自然分相，控制環(huán)境溫度為40°C;
[0033](3)、取步驟(2)混合溶液的上相，采用截留分子量為30KDa的超濾膜透過(guò)PEG1000，截留的γ -聚谷氨酸濃縮液經(jīng)-20°c冷凍后，于-50°c真空冷凍干燥24h，即得純品。