反應(yīng)的產(chǎn)率，引入七種濃度為0.8g/mL的咪唑類離子液體和四種濃度為 0.8g/mL的季銨鹽離子液體作為反應(yīng)體系共溶劑，其中七種咪唑類離子液體為:溴化-1-乙 基-3-甲基咪唑^1?頂][84、溴化-1-丙基-3-甲基咪唑[?]\〇]\1][8^、溴化-1-丁基-3-甲基咪 唑[BMM][Br]、溴化-1-戊基-3-甲基咪唑[AMM][Br]、氯化-1-乙基-3-甲基咪唑[EMM] [Cl]、l-丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸[PMIM][PF6]、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸[EMIM] [BF 4];四種季銨鹽離子液體為：四甲基溴化銨(TMAB)、四乙基溴化銨(TEAB)、四丙基溴化銨 (TPAB)、四丁基溴化銨(TBAB)。
[0045] 在反應(yīng)體系中加入2.5mL的0. lmol/L磷酸緩沖溶液和占磷酸緩沖溶液體積2%的 共溶劑離子液體溶液，其他條件同實(shí)施例1，考察離子液體種類對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率，2，3-環(huán)氧 蒎烷產(chǎn)率的影響。結(jié)果如圖1所示，其中，咪唑類的離子液體效果最好，陰離子為溴離子與氯 離子時(shí)產(chǎn)率相差不多，優(yōu)于陰離子為六氟磷酸與四氟硼酸，離子液體的陽(yáng)離子基團(tuán)大小不 同，其作用效果也不盡相同，引入[EMm][Br]效果最好，說(shuō)明離子液體陽(yáng)離子基團(tuán)越小越有 利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，2，3-環(huán)氧蒎烷的產(chǎn)率提高越多。
[0046] 實(shí)施例5
[0047] 考察了離子液體[EMIM] [Br]的用量對(duì)2，3-環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率的影響，磷酸緩沖溶液 (PBS)用量范圍2~3mL，離子液體共溶劑與磷酸緩沖溶液(PBS)的體積比V W_/VPBS = 0.1 % -3%，其他條件不變。結(jié)果如圖2所示，隨著[EiOM][Br]濃度的增大，2,3-環(huán)氧蒎烷的產(chǎn)率逐 漸增大，當(dāng)濃度增加到一定量時(shí)，產(chǎn)率又逐漸減小，可見酶對(duì)離子液體的耐受濃度有個(gè)最大 值，當(dāng)引入^1頂][8幻濃度為1.33%(￥ 1^/^他(^)時(shí)，2,3-環(huán)氧蒎烷的產(chǎn)率達(dá)到最大 86.46 %，底物轉(zhuǎn)化率100 %。
[0048] 對(duì)比例1
[0049] 由于CP0為親水性的酶，降冰片烯為疏水性底物，為了增加底物的溶解性，實(shí)施例4 中引入離子液體；因?yàn)橛袡C(jī)溶劑的添加也可以增加底物溶解度。對(duì)比加入50uL的離子液體 溶液和50uL的有機(jī)溶劑，觀察對(duì)2，3-環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率的影響。在此反應(yīng)中，有機(jī)溶劑與離子液 體起到兩個(gè)作用：一是增加了有機(jī)底物的溶解度，可以與CP0更好的發(fā)生反應(yīng)，提高反應(yīng)的 產(chǎn)率;二是由于CP0活性中心是深埋在血紅素內(nèi)部的，需要經(jīng)過(guò)一個(gè)底物通道才能與活性中 心接觸，加入共溶劑以后使CP0的底物通道暴露程度增大，也就是活性中心卟啉環(huán)的暴露程 度增加。
[0050] 根據(jù)有機(jī)溶劑的極性參數(shù)選擇了四種有機(jī)溶劑(正己烷(0.06)、甲醇(6.6)、1，4_ 二氧六環(huán)(4.8)、乙腈(6.2))作為反應(yīng)體系的共溶劑，取有機(jī)溶劑50uL，其他條件不變，考察 了不同有機(jī)溶劑對(duì)該環(huán)氧化反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)化率，2,3_環(huán)氧蒎烷產(chǎn)率及選擇性的影響，其中， 在乙腈中的產(chǎn)率最高為80%，底物轉(zhuǎn)化率88.6%，而[EMIM] [Br]離子液體的產(chǎn)率為 86.46%，底物轉(zhuǎn)化率100%，結(jié)果表明，相對(duì)有機(jī)溶劑，本發(fā)明添加的離子液體不僅作為綠 色的共溶劑，而且其添加效果優(yōu)于有機(jī)溶劑。
[0051 ] 對(duì)比例2
[0052]純緩沖液體系及添加少量離子液體、季銨鹽體系與有機(jī)溶劑體系的CP0催化氧化 降冰片烯體系分別的米氏常數(shù)心，轉(zhuǎn)化數(shù)列于表1。1^的增大是添加季銨鹽后 時(shí)產(chǎn)率提高的主要原因。而米氏常數(shù)Km的減小則表明CP0對(duì)底物降冰片烯的親和力不斷增 大。同時(shí)，k cat/Km的增大說(shuō)明這些共溶劑能夠提高CP0的對(duì)底物識(shí)別的專一性。其中添加 [EMIM] [Br]的酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化數(shù)kcat最大，米氏常數(shù)Km最小，kcat/K m增大最多，表明其增敏效 應(yīng)最強(qiáng)。
[0053]本發(fā)明設(shè)計(jì)了一條制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、綠色環(huán)保、高效的2,3_環(huán)氧蒎烷的合 成路線?？疾炝搜趸瘎┑奶砑臃绞綄?duì)環(huán)氧化反應(yīng)的影響，并探索最佳條件，對(duì)CPO催化H2〇2氧 化合成2，3-環(huán)氧蒎烷的影響因素分別進(jìn)行優(yōu)化，使反應(yīng)速率和產(chǎn)率達(dá)到最高。
[0054]表1磷酸緩沖溶液(PBS)中與引入離子液體、季銨鹽與有機(jī)溶劑時(shí)CP0催化環(huán)氧化 降冰片烯反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0055]
[0056] 實(shí)施例6
[0057] 將2.5uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、120uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃 度為1.2umol/L的CP0和40uL濃度為0.8g/mL的溴化-1-丙基-3-甲基咪唑離子液體，加入 0. lmol/L的pH = 4.5的磷酸緩沖溶液混合得到反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系的總體積為3mL，反應(yīng) 溫度為30°C，反應(yīng)lh。
[0058] 實(shí)施例7
[0059] 將4uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、180uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃度 為0.9umol/L的CP0和45uL濃度為0.8g/mL的四乙基溴化銨離子液體，加入0. lmol/L的pH= 5 的磷酸緩沖溶液混合得到反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系的總體積為3mL，反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)2h。 [0060] 實(shí)施例8
[0061 ] 將7.5uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、100uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃 度為1.5umol/L的CP0和55uL濃度為0.8g/mL的四丁基溴化銨離子液體，加入0. lmol/L的pH =5.5的磷酸緩沖溶液混合得到反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系的總體積為3mL，反應(yīng)溫度為40°C，反 應(yīng)3h。
[0062] 實(shí)施例9
[0063] 將6uL濃度為2mmol/L的底物降冰片烯、200uL的濃度為0.1mol/L的H2〇2、20uL濃度 為0.8umol/L的CP0和60uL濃度為0.8g/mL的氯化-1-乙基-3-甲基咪唑離子液體，加入 0. lmol/L的pH = 5的磷酸緩沖溶液混合得到反應(yīng)體系，使反應(yīng)體系的總體積為3mL，反應(yīng)溫 度為50°C，反應(yīng)4h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶促反應(yīng)制備2,3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，包括以下步驟:取降冰片烯、 雙氧水和氯過(guò)氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合形成反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)體系 中，降冰片烯、H2〇2、氯過(guò)氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩爾比為(0.005~0.015)umol:(10~ 20)umol: (12~30)X10-6umol: (2~3)mL〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，所述雙 氧水的濃度為0.lmol/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，所述氯 過(guò)氧化物酶溶液的濃度為〇 · 6~1 · 5umol/L〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，磷酸緩 沖溶液的濃度為O.lmol/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，磷酸緩 沖溶液的pH值為3.5~6。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，在反應(yīng) 體系中還添加有濃度為0.8g/mL的離子液體共溶劑，其中，離子液體共溶劑的體積占磷酸緩 沖溶液體積的0.1~3 %。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，離子液 體采用咪唑類離子液體或季銨鹽類離子液體。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2,3_環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，雙氧水 是間歇式加入，間歇時(shí)間是30min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，反應(yīng)溫 度為0~60°C。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶促反應(yīng)制備2，3-環(huán)氧蒎烷的方法，其特征在于，反應(yīng) 時(shí)間為1~6h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種酶促反應(yīng)制備2,3-環(huán)氧蒎烷的方法，包括以下步驟：取降冰片烯、雙氧水和氯過(guò)氧化物酶溶液加入磷酸緩沖溶液，混合形成反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在反應(yīng)體系中，降冰片烯、H2O2、氯過(guò)氧化物酶和磷酸緩沖溶液的摩爾比為(0.005～0.015)umol：(10～20)umol：(12～30)×10-6umol：(2～3)mL。本發(fā)明通過(guò)CPO作為催化劑，雙氧水作為氧化劑，催化高級(jí)烯烴——降冰片烯進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)合成2,3-環(huán)氧蒎烷，操作簡(jiǎn)單、快速高效、酶及氧化劑用量極少、反應(yīng)溫度較低、產(chǎn)率較高、選擇性高，本發(fā)明采用酶促反應(yīng)制備2,3-環(huán)氧蒎烷，克服了現(xiàn)有方法在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的問(wèn)題，綠色環(huán)保。
【IPC分類】C12P17/02
【公開號(hào)】CN105441503
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510969691
【發(fā)明人】蔣育澄, 王鳳嬌, 胡滿成, 李淑妮, 翟全國(guó)
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月21日