一種環(huán)二肽類化合物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用一株海洋真菌--半知菌綱殼霉目杯霉科青霉屬桔青霉 (Penicillium citrinum)MNPl2010101 制備環(huán)二肽的方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋天然產(chǎn)物已成為藥物先導(dǎo)化合物的重要來源之一。從20世紀(jì)60年代起，尋找 海洋來源的天然活性物質(zhì)已成為一大研究熱點(diǎn)。最初的研究，人們主要集中在一些海洋低 等生物，如軟體動(dòng)物，藻類、浮游生物等。隨著研究的深入，越來越多結(jié)構(gòu)奇特并具良好活性 的天然產(chǎn)物相繼被分離。1988年~1992年間，海洋微生物產(chǎn)生的新化合物幾乎從零升到 12.7%，而來源于陸棲真菌產(chǎn)生的新化合物已由74.7%下降到50.5%。
[0003] 常規(guī)方法培養(yǎng)海洋微生物，分離和篩選活性次生代謝產(chǎn)物，難度越來越大。如果利 用環(huán)境脅迫、調(diào)節(jié)生物合成途徑以及利用基因調(diào)控等手段，阻斷途徑特異性抑制子或激活 相關(guān)的"沉默"基因，激活隱性次生代謝產(chǎn)物生物合成，挖掘海洋微生物合成次代謝產(chǎn)物的 能力，從新合成的代謝中篩選具有生物活性物質(zhì)，則有望篩選到新型生物活性物質(zhì)或先導(dǎo) 化合物。
[0004] 在前期研究中，從海水中分離到一株桔青霉MNP12010101菌株（中國(guó)發(fā)明專利 ZL201210572388.3)能夠產(chǎn)生抑制神經(jīng)癌細(xì)胞(PC12)，肝癌細(xì)胞(HepG2)和組織細(xì)胞淋巴瘤 細(xì)胞(U937)的活性物質(zhì)。是一個(gè)表現(xiàn)"突出"的海洋真菌，但從霉菌合成次生代謝產(chǎn)物多樣 性角度看，合成活性次生代謝產(chǎn)物的能力還沒有完全"發(fā)揮"。如采用環(huán)境脅迫激活桔青霉 "沉默"基因的表達(dá)，產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物，就有可能篩選到更多或活性更好的次生代 謝產(chǎn)物。本發(fā)明采用高濃度的鈷離子脅迫培養(yǎng)桔青霉MNP 12010101菌株，從代謝產(chǎn)物中獲 得具有生物活性的化合物。
[0005] 環(huán)二肽（cyclic dipeptides)，又名2，5_二氧哌嗪（2,5-dioxopiperazines)或2， 5-二酮哌嗪(2,5-(111^1：(^1口6瓜2；[1168)，由兩個(gè)氨基酸通過肽鍵環(huán)合形成，是自然界中最小 的環(huán)肽。環(huán)二肽在人、脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)，由于它們的結(jié) 構(gòu)中有一個(gè)穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有一定的構(gòu)象約束作用，有2個(gè)氫鍵給體和2個(gè)氫鍵受體， 氫鍵是藥物與受體相互作用的主要方式之一，因而環(huán)二肽在藥物化學(xué)中是一個(gè)重要的藥效 團(tuán)，目前發(fā)現(xiàn)許多環(huán)二肽具有較好的生理活性，如影響胞間信息傳遞、抑菌、抑制毒素活性、 促癌細(xì)胞凋亡、鎮(zhèn)痛以及免疫增強(qiáng)等。近些年來引起了有機(jī)化學(xué)、生物學(xué)和藥物學(xué)研究領(lǐng)域 的廣泛興趣。作為肽類化合物中最具有特點(diǎn)的一類化合物，其生物活性方面具有巨大的發(fā) 掘和開發(fā)潛力。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及利用一株海洋真菌一半知菌綱殼霉目杯霉科青霉屬桔青霉 (Penicillium citrinum)MNP12010101制備環(huán)二肽類化合物（即環(huán)(甘-脯）二肽、環(huán)（丙-脯） 二肽、環(huán)(異亮-脯)二肽和環(huán)(丙-纈)二肽）的方法。采用常規(guī)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)該菌株 產(chǎn)生環(huán)二肽，但在培養(yǎng)基中添加高濃度的鈷離子(是常規(guī)微生物培養(yǎng)基的200~1000倍），創(chuàng) 造了一種重金屬離子脅迫環(huán)境，菌體代謝途徑受到影響，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)量有所下降，但發(fā)酵 總浸膏的抗腫瘤活性則相對(duì)提高，從總浸膏中分離得到上述4種環(huán)二肽類化合物。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008]本發(fā)明提供一種環(huán)二肽類化合物的制備方法，所述方法是將桔青霉(Peni ci 11 ium citrinum)MNP12010101接種在含鈷離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25~30°C、200~250r/min恒溫 振蕩條件下培養(yǎng)5~7d后（即培養(yǎng)至菌體干重達(dá)到10~12g/L)，再于25~30°C下靜置4~5d， 將培養(yǎng)液分離純化，獲得環(huán)二肽類化合物（即環(huán)(甘-脯)二肽、環(huán)(丙-脯)二肽、環(huán)(異亮-脯） 二肽和環(huán)(丙-纈)二肽）；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10~20g/L，蛋白胨2~5g/L，酵母 浸膏1~2g/L，溶劑為體積比1:1~2的人工海水與蒸餾水混合液，pH 6~7,高壓蒸汽121°C 滅菌 15~20min;所述每升人工海水組成為：NaC124.48g，Na2S〇4 3.917g，KCl 0.664g，KBr 0.096g,SrCl2 0.024g,MgCl · 6H2O 4.981g,CaCl2 · H20 1.102g,NaHC03 0.192g,H3B03 0.026g，NaF 0.004g，用蒸餾水定容至1L。
[0009]進(jìn)一步，所述鈷離子以氯化鈷的形式加入，所述氯化鈷在發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度 為1~2g/L，優(yōu)選lg/L，是常規(guī)微生物培養(yǎng)基的200~1000倍。
[0010]進(jìn)一步，優(yōu)選所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/ L，溶劑為體積比1:1.5的人工海水與蒸餾水混合液，pH 7.0。
[0011 ] 本發(fā)明所述桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101在發(fā)酵培養(yǎng)前先進(jìn)行斜 面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)：
[0012] (1)斜面培養(yǎng)：將桔青霉MNP12010101接種于斜面培養(yǎng)基，于25~30°C培養(yǎng)48~ 60h，獲得斜面菌種孢子;所述的斜面培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯150~250g/L(煮沸30min后過濾 去渣），葡萄糖15~30g/L，瓊脂18~20g/L，溶劑為人工海水，pH自然，高壓蒸汽121°C滅菌15 ~20min;所述人工海水組成同發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0013] (2)種子培養(yǎng)：將桔青霉MNP12010101的活化培養(yǎng)的菌種孢子接種于種子培養(yǎng)基 中，于25~30°C、150~250r/min振蕩條件下培養(yǎng)36~48h，得種子液;所述的種子培養(yǎng)基組 成為:葡萄糖10~20g/L，蛋白胨2~5g/L，酵母浸膏1~2g/L，溶劑為體積比1:1~2的人工海 水與蒸餾水混合液，pH 6~7,高壓蒸汽121°C滅菌15~20min;所述人工海水組成同發(fā)酵培 養(yǎng)基。
[0014] 本發(fā)明將桔青霉MNP12010101經(jīng)過活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，得到含環(huán)二肽 的培養(yǎng)物，培養(yǎng)物經(jīng)過提取分離純化，可獲得4種環(huán)二肽類化合物，即環(huán)（甘-脯）二肽、環(huán) (丙-脯)二肽、環(huán)(異亮-脯)二肽和環(huán)(丙-纈)二肽，具體本發(fā)明所述從培養(yǎng)液分離純化獲得 環(huán)二肽類化合物的方法為：
[0015] (1)將培養(yǎng)液過濾，濾液用同體積的乙酸乙酯萃取3~5遍，合并萃取液，于45°C減 壓蒸餾除去乙酸乙酯，所得膏狀物即為發(fā)酵液提取物;濾餅用等同過濾前培養(yǎng)液體積的甲 醇浸泡12~24h，再于25°C、100KHz超聲提取30~60min，二次過濾除去菌體，二次濾液于50 °C減壓蒸餾除去甲醇和水分，所得二次膏狀物用甲醇溶解，離心棄去沉淀，上清液再次于50 °C減壓蒸餾除去甲醇，反復(fù)1~3次，獲得菌體提取物，合并發(fā)酵液提取物和菌體提取物，BP 為發(fā)酵總浸膏；
[0016] (2)將步驟（1)制備的發(fā)酵總浸膏用少量甲醇溶解后采用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行 分離，先用2倍柱體積的純水淋洗，洗脫液棄去，再分別用2倍柱體積的體積濃度為20%、 40%、60%的乙醇水溶液洗脫，分別收集流出液Π、流出液f2和流出液f3，減壓濃縮至膏狀， 獲得膏狀物F1、膏狀物F2和膏狀物F3;
[0017] (3)將步驟(2)中膏狀物F1用少量甲醇溶解后進(jìn)行MCI層析分離，分別用2個(gè)柱體積 的體積濃度10 %和體積濃度20 %的乙醇水溶液洗脫，分別收集流出液f 4和流出液f 5，流出 液f4減壓濃縮后獲得的膏狀物F4用少量甲醇溶解再經(jīng)0DS-C18柱純化，以體積濃度11%的 甲醇水溶液為流動(dòng)相，收集主峰的流出液，蒸干溶劑后，即得環(huán)(甘-脯)二肽;流出液f5減壓 濃縮后獲得的膏狀物F5用少量甲醇溶解再經(jīng)0DS-C18柱純化，以體積濃度19%的甲醇水溶 液為流動(dòng)相，收集2個(gè)主峰流出液，蒸干溶劑后，即得環(huán)(丙-脯)二肽和環(huán)(異亮-脯)二肽；
[0018] (4)將步驟（2)中膏狀物F3用少量甲醇溶解后采用MCI層析柱分離，用體積濃度 45 %的乙醇水溶液洗脫，收集流出液f6濃縮后獲得的膏狀物F6用少量甲醇溶解再經(jīng)0DS-C18柱純化，以體積濃度47 %的甲醇水溶液為流動(dòng)相，收集主峰流出液，蒸干溶劑后，即得環(huán) (丙-繳)二肽。
[0019] 本發(fā)明用于制備環(huán)二肽的產(chǎn)生菌種為桔青霉MNP12010101菌株，保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC No:M2012318，保藏日期2012年8月28日。該菌株的分離、 鑒定以及保藏已在中國(guó)發(fā)明專利ZL201210572388.3公開。
[0020] 本發(fā)明所述流出液Π、流出液f2、流出液f3、流出液f4、流出液f 5和流出液f 6，均指 收集的流出液，膏狀物F1、膏狀物F2、膏狀物F3,膏狀物F4、膏狀物F5和膏狀物F6,均指膏狀 物，為了便于表述不同步驟及組分而命名，字母本身沒有含義。
[0021]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1)采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，桔青霉MNP12010101 細(xì)胞合成了常規(guī)培養(yǎng)條件下不能合成的環(huán)二肽類化合物；（2)培養(yǎng)基組成簡(jiǎn)單，工藝簡(jiǎn)單， 發(fā)酵成本低；（3)桔青霉MNP 12010101細(xì)胞合成的環(huán)二肽具有抗腫瘤活性。 (四）
【附圖說明】
[0022]圖1桔青霉MNP12010101在常規(guī)培養(yǎng)(A)與1.0g/L氯化鈷脅迫培養(yǎng)(B)發(fā)酵總浸膏 的HPLC的圖譜。
[0023]圖2桔青霉MNP12010101發(fā)酵液浸膏中單體化合物分離流程圖，F(xiàn)1-F6分別表示不 同分離階段的洗脫液濃縮物。
[0024]圖3分離得到的4種環(huán)二肽在HPLC圖譜中對(duì)應(yīng)出峰位點(diǎn)。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0026] 本發(fā)明實(shí)施例中所述每升人工海水組成為：NaCl 24.48g，Na2S〇4 3.917g， KC10.664g,KBr 0.096g,SrCl2 0.024g,MgC