一種維生素a棕櫚酸酯的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種維生素A棕櫚酸酯合成的新工藝，化學(xué)酶法合成維生素A棕櫚酸 酯，即有機(jī)溶劑作助溶劑，用堿液水解維生素A醋酸酯，生成維生素A醇；用有機(jī)溶劑萃取維 生素A醇，水洗萃取液除去能與棕櫚酸反應(yīng)的助溶劑，固定化脂肪酶在非水相體系中催化 維生素A醇與棕櫚酸反應(yīng)合成維生素A棕櫚酸酯。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素A的化學(xué)名為視黃醇，是最早被發(fā)現(xiàn)的維生素，一種天然的脂溶性維生素， 人體必需的營養(yǎng)素之一，1913年美國臺維斯等4位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)魚肝油可以治愈干眼病，并 從魚肝油中提純出一種黃色粘稠液體。1920年英國科學(xué)家曼俄特將其正式命名為維生素 A，國際上正式將維生素A看作營養(yǎng)上的必需因素，它參與機(jī)體的多種生理過程?？梢跃S持 正常的視覺反應(yīng)，維護(hù)上皮組織的正常形態(tài)和功能，維持正常的骨骼發(fā)育，維護(hù)皮膚細(xì)胞功 能。但是維生素A非常不穩(wěn)定，遇酸、空氣、氧化性物質(zhì)、高溫或紫外線等容易被破壞，且對 皮膚有刺激性。維生素A酯類衍生物較維生素A更加穩(wěn)定，且不具有刺激性，因此商品維生 素A都以酯的形式提供市場，且較多為維生素A醋酸酯和維生素A棕櫚酸酯，維生素A棕 櫚酸酯作為維生素A最主要的系列產(chǎn)品之一，由于其更好的穩(wěn)定性及更優(yōu)的藥理作用，其 需求量日益增大，已廣泛應(yīng)用于化妝品、藥物、飼料等。目前，維生素A棕櫚酸酯的生產(chǎn)仍主 要依賴于化學(xué)法，市場上維生素A棕櫚酸酯的市場供應(yīng)主要被瑞士的Roche公司和德國的 BASF公司所壟斷。然而化學(xué)法合成工藝復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，副反應(yīng)多，副產(chǎn)物多，給后續(xù)產(chǎn) 物分離帶來很大困難，且能耗高，對環(huán)境影響大，因此尋求一種綠色制造工藝成為亟待解決 的問題。
[0003] 酶是具有高度選擇性的生物催化劑，可利用其代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)催化劑合成各種產(chǎn) 物，酶作為一種綠色高分子催化劑，在有機(jī)合成方面的使用已經(jīng)成為一項(xiàng)日益有吸引力的 替代傳統(tǒng)的化學(xué)催化。1984 年美國 Massachusetts Institute Of Technology (MIT)的 Klibanov A. M.在Science上首次發(fā)表了非水介質(zhì)中脂肪酶的催化行為及熱穩(wěn)定性的研 究，從此非水酶學(xué)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展并取得了突破性的進(jìn)展。酶在非水介質(zhì)中的催化可以 增加非極性底物的溶解度，增加底物濃度，提高反應(yīng)速度，改變熱力學(xué)平衡，有利于產(chǎn)物的 生成，減少因水引起的副反應(yīng)，有利于酶與產(chǎn)物的分離及酶的再利用，簡化生產(chǎn)工藝。近年 以固定化脂肪酶為生物催化劑，在非水介質(zhì)中催化合成維生素A棕櫚酸酯成為綠色生物催 化研究的主要方向，但是目前酶法合成主要以維生素A醋酸酯與棕櫚酸轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成維 生素A棕櫚酸酯，由于底物濃度低，反應(yīng)時間長，產(chǎn)率低，且產(chǎn)物收率低，生產(chǎn)成本高等問 題，諸多不利因素嚴(yán)重阻礙了維生素A棕櫚酸酯綠色生物催化技術(shù)的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。 因此，提高底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的收率，實(shí)現(xiàn)過程的綠色化，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是現(xiàn)在急需解 決的問題。但是目前，酶法合成主要以維生素A醋酸酯與棕櫚酸轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成維生素A 棕櫚酸酯，底物濃度低，反應(yīng)時間長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] "譚天偉，劉濤，尹春華"在"一種用固定化脂肪酶催化合成維生素A脂肪酸酯的方 法"（中國專利申請200310116834.0,2003)中公開了一種用固定化脂肪酶催化合成維生素 A棕櫚酸酯的方法，在10mL正己烷反應(yīng)體系中，以解脂假絲酵母脂肪酶為催化劑，棉布作為 固定化載體，〇. lg維生素A醋酸酯和0.234g棕櫚酸（底物摩爾比1:3)為底物，30°C反應(yīng) 24小時，轉(zhuǎn)化率達(dá)79%。
[0005] "阮暉，徐娟"在"酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯的方法"（中國專利 申請201110110428. 8, 2011)中公開了一種用酵母展示脂肪酶催化合成維生素A棕櫚酸酯 的方法，在10mL正己烷反應(yīng)體系中，0. 328g維生素A醋酸酯和1. 282g棕櫚酸（底物摩爾比 1:5)為底物，加入0. 5g酵母展示脂肪酶，無氧條件下250rpm/min，45°C反應(yīng)12小時轉(zhuǎn)化率 達(dá)90 %，底物濃度只有32. 8g/L，90 %的轉(zhuǎn)換率完全達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)要求，且后續(xù)分離會 很困難。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了實(shí)現(xiàn)維生素A棕櫚酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)，針對以上存在的不足和需要解決的技 術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種維生素A棕櫚酸酯合成的新工藝，即化學(xué)酶法合成維生素A棕櫚 酸酯。
[0007] 本發(fā)明為兩步法合成維生素A棕櫚酸酯：以有機(jī)溶劑作助溶劑，堿液水解維生素A 醋酸酯，生成維生素A醇；用萃取劑萃取維生素A醇，水洗上層有機(jī)相除去能與棕櫚酸反應(yīng) 的助溶劑，固定化脂肪酶在非水相體系中催化維生素A醇與棕櫚酸反應(yīng)合成維生素A棕櫚 酸酯。本發(fā)明化學(xué)酶法催化合成維生素A棕櫚酸酯的催化機(jī)理如圖3所示。
[0008] -種維生素A棕櫚酸酯的合成方法，所述合成方法為：（1)以維生素A醋酸酯為底 物，以堿液為溶劑，以有機(jī)溶劑為助溶劑，在150~200rpm，15~20°C條件下進(jìn)行水解反應(yīng)， 反應(yīng)完全后，獲得水解反應(yīng)液；所述堿液的體積用量以堿物質(zhì)的量計(jì)，所述底物與堿物質(zhì)的 量之比為1 :1~4 ;所述有機(jī)溶劑的體積用量以底物質(zhì)量計(jì)為0. 5~10ml/g(優(yōu)選2. 5~ 10ml/g);所述有機(jī)溶劑為甲醇、無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙腈或丙酮；（2)向步 驟（1)獲得的水解反應(yīng)液中加入萃取劑，取上層有機(jī)相用蒸餾水洗滌后再加入無水硫酸鈉 干燥，分層，取上層獲得預(yù)處理后的萃取液；所述萃取劑為異辛烷、正庚烷、石油醚、正己烷 或環(huán)己烷；（3)向步驟（2)獲得的預(yù)處理后的萃取液中加入棕櫚酸，無水硫酸鎂和固定化脂 肪酶構(gòu)成酯化反應(yīng)體系，在20~70°C，180rpm條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液 后處理，獲得維生素A棕櫚酸酯；所述固定化脂肪酶是將含南極假絲酵母脂肪酶B基因的重 組基因工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)液離心，取上清液提取脂肪酶，然后將脂肪酶用pH值為6的緩沖液 配制成酶液，以大孔樹脂為載體進(jìn)行吸附固定化，抽濾，濾餅即獲得固定化脂肪酶，所述南 極假絲酵母脂肪酶B基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示；所述棕櫚酸與步驟（1)加入 的維生素A醋酸酯物質(zhì)的量之比為1~2. 5 :1 (最優(yōu)選1. 1:1)，所述無水硫酸鎂添加量以 萃取液體積計(jì)為〇. 02~0. lg/mL(優(yōu)選0. 05g/mL);所述固定化脂肪酶與步驟（1)加入的 維生素A醋酸酯質(zhì)量比為0. 05~0. 35 :1 (最優(yōu)選0. 1:1)。
[0009] 進(jìn)一步，優(yōu)選步驟（1)所述堿液為5mol/L的Κ0Η水溶液。
[0010] 進(jìn)一步，優(yōu)選步驟（1)所述有機(jī)溶劑為無水乙醇或正丙醇，更優(yōu)選無水乙醇。
[0011] 進(jìn)一步，優(yōu)選步驟（1)所述水解反應(yīng)在16°c，200rpm條件下水解30~90min。
[0012] 進(jìn)一步，優(yōu)選步驟（2)所述上層有機(jī)相用蒸餾水洗滌4~6次。
[0013] 進(jìn)一步，優(yōu)選步驟（2)所述萃取劑為正己烷。
[0014] 進(jìn)一步，步驟（3)所述固定化脂肪酶按如下步驟制備：
[0015] (1)將含有南極假絲酵母（Candida antarctica)ZJB09193脂肪酶編碼基因的表 達(dá)載體pPICZa A-CALB利用SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母（Pichia pastoris)X33中， 涂布于含終濃度lOOyg/yL Zeocin (博來霉素）的YPD平板上，30°C培養(yǎng)三天，將含有 CALB基因的陽性轉(zhuǎn)化子接種至BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)1天，然后按體積濃度5%的接種 量接種于BMMY培養(yǎng)基中，甲醇作為誘導(dǎo)劑，每隔8h添加一次，誘導(dǎo)劑每次加入量為0. lmL/ mL BMMY培養(yǎng)基，28°C，250rpm誘導(dǎo)表達(dá)68~72h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液；YH)培養(yǎng)基終濃度組 成：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，質(zhì)量濃度2. 0%瓊脂，溶劑為水，pH自 然；每升BMGY培養(yǎng)基組成：酵母提取物10g，蛋白胨20g，1M、ρΗ6. 0ΚΡ04緩沖液100mL，酵母 氮基3. 4g，硫酸銨10g，甘油lOmL，加蒸饋水至1L，pH自然，BMGY培養(yǎng)基配好后，滅菌，冷卻 至室溫，每升加2mL 500X生物素，10. 4mL 96X組氨酸；每升BMMY培養(yǎng)基組成：酵母提取 物l〇g，蛋白胨20g，1M ΚΡ04緩沖液pH6. OlOOmL，酵母氮基（即YNB) 3. 4g，硫酸銨10g，加蒸餾 水至lL，pH自然，BMMY培養(yǎng)基配好后，滅菌，冷卻至室溫，每升加2mL 500X生物素，10. 4mL 96X組氨酸和5