一種天?？朴紫x不同家系的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種天?？朴紫x不同家系的分子標(biāo)記 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 天牛幼蟲的分類研究主要集中在個(gè)體形態(tài)學(xué)領(lǐng)域，但由于幼蟲分離鑒定資料極其 缺乏，許多種類的幼蟲形態(tài)迄今尚未描述；不同地理分布的同種天牛幼蟲，形態(tài)有一定差 異；親緣關(guān)系較近的種類，形態(tài)非常相似，鑒定時(shí)容易混淆。因此，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， 核酸序列分析（DNA sequenceanalysis)被越來(lái)越多地用于天牛幼蟲的分子鑒定，在出入境 檢驗(yàn)檢疫工作中具有重要意義。
[0003] 線粒體DNA (mtDNA)分子量較小，遵循母系遺傳，進(jìn)化速率快，是分子分類學(xué)重要 的標(biāo)記之一。其細(xì)胞色素氧化酶I、II (C0I、C0 II )在近緣種及種下階元的分類鑒定以及 不同地理種群的遺傳變異中應(yīng)用較廣。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于昆蟲種群間的親 緣關(guān)系分析。C0I基因在昆蟲近緣種及種下階元的分類系統(tǒng)研究中應(yīng)用較廣。安榆林等 (2004)用mtDNA序列分析了光肩星天牛mtDNA的特點(diǎn)，得出mtDNA可用于天牛不同地理種 群及近緣種的的鑒定和系統(tǒng)遺傳分析。張凱（2013)將Z i/?cWiiM?Pascoe的mtDNACOI序 列與來(lái)自幽天牛亞科、天牛亞科、溝腔天牛亞科的不同種天牛的mtDNACOI序列構(gòu)建NJ系統(tǒng) 樹，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化關(guān)系上與天牛亞科最近。
[0005] DNA條形碼技術(shù)通常是利用線粒體C0I5'端序列將物種鑒定到種水平的一種鑒 定方法（Hebert等，2003)。Hebert等（2003)對(duì)包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物動(dòng)物界的 C0I基因序列比較分析得出：除腔腸動(dòng)物外，98%同屬物種的C0I種間遺傳距離差異平均為 11. 3%，不同屬物種的C0I遺傳距離差異更大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種天?？朴紫x不 同家系的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明通過(guò)對(duì)口岸經(jīng)常截獲的天?？艭0I基因進(jìn)行擴(kuò)增，同網(wǎng)上 登錄序列進(jìn)行比較，分析其基因組成及變異，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其分類地位。以期在 實(shí)際工作中輔助天?？朴紫x分類鑒定，為形態(tài)學(xué)分類做補(bǔ)充，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
[0007] 技術(shù)方案：為了解決上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種天牛科幼蟲不 同家系的分子標(biāo)記方法，采用以下步驟實(shí)現(xiàn)： 1)選用兩對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述兩對(duì)特異性引物為 上游引物 J173 :5' - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' 下游引物 J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' ； 上游引物 J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' 下游引物 N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3' ； 2) 從待測(cè)不同家系的天牛個(gè)體及親本，采用DNA提取法提取基因組DNA ; 3) 用步驟2)的基因組DNA為模板，步驟1)所選的兩對(duì)引物分別進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增； 4) 對(duì)步驟3)的PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖電泳檢測(cè)，溴化乙錠染色后紫外線下觀察并拍 照電泳結(jié)果，剩余部分送上海金斯瑞有限公司純化并測(cè)序； 5) 獲得的DNA序列先提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，然后利用BLAST工具進(jìn)行相似性檢 索，并確定片段方向；用GenDoc軟件進(jìn)行序列同源性比較；用MEGA5. 0軟件，計(jì)算各物種間 的遺傳距離，轉(zhuǎn)換和顛換值及其比值，保守位點(diǎn)及變異位點(diǎn)等數(shù)值，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育 樹，根據(jù)個(gè)體間的遺傳距離聚類結(jié)果，區(qū)分來(lái)自不同家系的個(gè)體。
[0008] 在步驟3)中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)體系采用50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，其中含 有 10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ 1，2. 5 mmol/L 的 dNTPs 4 μ 1，ragDNA 聚合酶 0· 4 μ 1， cDNA模板2μ 1，上下游引物各1 μ 1，后加 ddH20補(bǔ)足5〇μ1。
[0009] 在步驟3)中，第一輪PCR反應(yīng)的條件為：94 °C預(yù)變性3min ;94 °C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后再72 °C延伸10 min。
[0010] 在步驟3)中，第二輪PCR反應(yīng)的條件為：94 °C預(yù)變性3min ;94 °C變性30s，47°C 退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后再72 °C延伸10 min。
[0011] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明對(duì)33種天牛C0I基因的遺 傳距離表明：該片段C0I基因在斷眼天牛屬3種天牛種間的遺傳距離介于0. 052~0. 087 間；其余天牛種間的遺傳距離介于〇. 〇75~0. 292間，不同屬間遺傳距離明顯大于同屬間遺 傳距離，C0I基因完全符合DNA條形碼有效性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，該片段可以較好的區(qū)分天牛的 不同屬的不同種類，可用于天?？频目焖勹b定。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1PCR方法特異性實(shí)驗(yàn)的電泳圖；俄羅斯天牛幼蟲擴(kuò)增出了一條481bp的片段， 參見泳道1和泳道2,其他天牛均未擴(kuò)增出片段，參見泳道； 圖2a和圖2b天牛C0I基因的遺傳距尚； 圖3天牛C0I序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明。
[0014] 實(shí)施例1 : 1、試驗(yàn)材料： 所用天牛標(biāo)本均為江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局各口岸昆蟲實(shí)驗(yàn)室多年截獲的標(biāo)本。5種標(biāo) 本來(lái)源和采集時(shí)間見表1。此外，選取Genbank登錄的28種天牛C0I基因序列進(jìn)行比對(duì)，見 表2。
[0015] 表1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本名稱和來(lái)源 表2Genbank下載序列信息 2、基因組總DNA的提取 采用GenMag動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒：將酒精浸泡過(guò)的蟲體，選擇適當(dāng) 大小的肌肉組織，無(wú)菌水清洗2-3次，浙干水分后，將組織進(jìn)行研磨，加入適量的裂解液和 蛋白酶K，55 °C溫浴，使得組織完全裂解。再加入磁珠和緩沖液，使DNA吸附到磁珠上，使用 Wash Buffer進(jìn)行除雜，除雜完畢后，加入少量的Elution Buffer，將DNA溶解，得到基因組 DNA溶液，-20°C保存。
[0016] 3、C0I基因擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增采用巢式PCR，所用引物分別為： 第一輪：J173 :5, - TAACAGCACATGCTTTTGTA-3' J1331 :5' -GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3' 第二輪：J1718 :5' -GGAGGAITTGGAAATTGATTAGTTCC-3' N2191 :5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3'，均由上海金斯瑞有限公司合成。
[0017] PCR反應(yīng)體系采用50μ 1標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，其中含有10XPCR Buffer (Mg2+)5 μ 1， dNTPs(2.5mmol/L)4 ylJai/DNA